miR--424及其參與的Cul2-E2F1-miR--424調控環(huán)路在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機制研究.pdf

1、宮頸癌是全球女性常見惡性腫瘤和癌癥相關死亡原因之一，嚴重危害婦女健康。宮頸癌也是迄今病因最為明確的腫瘤，高危人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HR-HPV）持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的必需因素。但婦女一生中發(fā)生生殖道HPV感染的幾率高達80％，大部分在HPV感染后2年內便自行消退，僅5-10％呈持續(xù)感染狀態(tài)，而發(fā)生宮頸癌的幾率不足1％。另外，大量研究表明采用單純靶向HR-HPV關鍵致癌蛋白E6/E7表達的各種方法均不能完全

2、阻遏宮頸癌細胞的惡性表型，迄今尚無治療性HPV疫苗問世。由此可見，HR-HPV的感染結局取決于病毒和宿主的兩個方面，只有從病毒與宿主交互影響入手，方能闡明病毒致癌過程的關鍵環(huán)節(jié)與關鍵分子，從而為包括宮頸癌在內的各種HPV相關癌癥開啟全新的防治策略。
　　非編碼微小RNA(microRNAs，miRNAs)參與調控人類近1/3基因的表達。miRNAs是一類非編碼的單鏈小分子RNA，主要通過與靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)(3'-UT

3、R)互補結合，在轉錄后水平調控靶基因的表達，參與機體的生長、發(fā)育、分化、代謝和死亡等幾乎所有重要的生理過程。近年的研究進一步證實，miRNAs具有抑癌基因或癌基因的功能，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，并在病毒感染性疾病中影響病毒的感染、清除和復制等過程。與基因網(wǎng)絡和蛋白網(wǎng)絡相比，miRNAs作為一種新的強有力的工具，在闡明發(fā)病機制和確定治療靶點的研究中更具獨特優(yōu)勢。因此，將miRNAs作為切入點進一步研究很可能為揭示HR-HPV致宮頸癌發(fā)生

4、發(fā)展的分子機制帶來新的突破。
　　在我們以往檢測的HPV陰性正常宮頸組織和HPV16陽性宮頸癌組織的高通量miRNA表達譜芯片中發(fā)現(xiàn)，miR-424在宮頸癌組織的表達較正常宮頸組織明顯下降。雖然關于miR-424的研究較少，但其功能比較明確，對細胞分化、增殖、周期和血管生成均有調控作用，而惡性腫瘤的發(fā)生往往表現(xiàn)為這些細胞功能的失調控。為了確定miR-424在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用和調控機制，本研究首先通過組織驗證、臨床病理參數(shù)

5、分析和細胞功能驗證確定miR-424在宮頸癌中的作用;其次通過靶基因確定和針對靶基因的組織和功能研究明確miR-424發(fā)揮生物學功能的機制;然后分析并尋找引起miR-424表達失調的基因或可能存在的調控環(huán)路;最后探討miR-424在宮頸癌中的表達抑制與HPV16癌蛋白間的關系。本研究旨在揭示宮頸癌發(fā)生發(fā)展的新機制，并為探尋宮頸癌防治新策略提供實驗證據(jù)。
　　第一部分 miR-424在宮頸癌中的表達及功能
　　目的:
　

6、　驗證miR-424在宮頸癌組織中表達下降，分析miR-424與宮頸癌臨床病理參數(shù)間的相關性及明確miR-424對宮頸癌細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的調控作用。
　　方法:
　　收集宮頸正常上皮組織和宮頸癌組織標本，采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR）法檢測74例宮頸正常上皮組織和147例宮頸癌組織的miR-424表達水平，同時整理完整的臨床病理

7、資料，分析miR-424的表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關性。利用細胞轉染技術分別在宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中轉染miR-424模擬物（mimic）或模擬物陰性對照，MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力、BrdU聯(lián)合7AAD法動態(tài)監(jiān)測各組細胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測細胞凋亡、劃痕實驗檢測細胞的遷移能力和Transwell聯(lián)合matrigel實驗檢測細胞的侵襲能力。
　　結果:
　　1.miR-424在宮頸癌

8、組織中的表達較宮頸正常組織顯著下調。
　　2.miR-424表達水平與宮頸癌預后不良相關的臨床病理參數(shù)，如細胞分化、FIGO分期、淋巴結轉移、深間質浸潤和脈管浸潤均呈顯著負相關。
　　3.宮頸癌細胞株SiHa和CaSki中恢復miR-424的表達能抑制腫瘤細胞的增殖能力，促使細胞周期發(fā)生G1/S期阻滯和促進細胞早期凋亡，同時細胞的遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。
　　結論:
　　1.miR-424表達在宮頸癌組織中

9、顯著下降，并與宮頸癌不良預后因素密切相關。
　　2.miR-424抑制宮頸癌細胞增殖、誘導細胞周期G1/S期阻滯和促進細胞凋亡，并抑制細胞遷移和侵襲能力，提示miR-424在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌作用。
　　第二部分 miR-424通過靶向細胞周期檢查點激酶1(Chk1)參與宮頸癌進展
　　目的:
　　確定miR-424發(fā)揮功能的靶基因，揭示miR-424在宮頸癌中的作用機制。
　　方法:
　　

10、首先，分別在宮頸癌SiHa和CaSki細胞中高表達miR-424，qRT-PCR檢測Chk1mRNA的表達水平，western blot檢測Chk1及其活性蛋白p-Chk1(Ser345)的蛋白表達水平。其次，雙熒光素酶報告基因檢測聯(lián)合定點突變法確定miR-424對Chk1的直接靶向作用。然后，利用siRNA特異性干擾宮頸癌細胞中Chk1的表達，westernblot檢測金屬蛋白酶MMP9的表達，MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力、BrdU

11、聯(lián)合7AAD法動態(tài)監(jiān)測細胞周期分布、Annexin-Ⅴ聯(lián)合PI法檢測細胞凋亡、劃痕實驗檢測細胞的遷移能力和Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力。最后，在已檢測過miR-424表達水平的同一批宮頸組織標本中采用免疫組織化學法檢測Chk1和p-Chk1的蛋白表達水平及與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關系，并分析與miR-424的組織相關性。利用western blot法在另外收集的20例宮頸正常組織和40例宮頸癌組織中再次驗證Chk1和p-Chk

12、1的蛋白表達水平。在宮頸癌組織中分析Chk1、p-Chk1和MMP9的組織相關性及與淋巴轉移的關系，明確Chk1在宮頸癌進展中的作用和調控分子。
　　結果:
　　1.miR-424高表達抑制Chk1和p-Chk1的蛋白表達水平，但不影響Chk1的mRNA水平。
　　2.miR-424與含Chk13'UTR區(qū)的報告基因質粒共轉染，可下調熒火蟲酶的活性，但將Chk13'UTR上miR-424的識別位點進行點突變后再與miR

13、-424共轉染，熒火蟲酶的活性不受影響。
　　3.干擾宮頸癌細胞Chk1的表達可抑制MMP9的蛋白水平，細胞增殖能力受阻，阻止細胞進入S期，細胞周期阻滯于G1期，細胞凋亡水平增加，細胞的遷移和侵襲能力均受抑制。
　　4.Chk1和p-Chk1在宮頸癌組織中的表達水平均較宮頸正常組織明顯增高，且與多項宮頸癌預后不良相關的臨床病理參數(shù)呈顯著正相關，與miR-424水平呈顯著負相關。宮頸癌組織中，Chk1、p-Chk1和MMP9的

14、表達呈顯著正相關，三者在淋巴結陽性的宮頸癌組織中的表達均較淋巴結陰性的宮頸癌組織明顯增高。
　　結論:
　　1.miR-424直接靶向Chk1，并抑制p-Chk1的表達，提示Chk1是介導miR-424調控宮頸癌細胞生物學功能的主要效應分子。
　　2.Chk1可能通過轉化為活性蛋白p-Chk1和正向調控MMP9的表達來促進宮頸癌細胞的侵襲轉移能力。
　　3.Chk1和p-Chk1高表達與宮頸癌不良預后因素密切相關

15、。
　　第三部分 Cul2/E2F1/miR-424調控環(huán)路引起宮頸癌細胞miR-424持續(xù)性表達抑制
　　目的:
　　證明在宮頸癌細胞中存在Cul2/E2F1/miR-424調控環(huán)路，及其對miR-424表達的調控，從而揭示宮頸癌細胞中miR-424持續(xù)性表達失調的原因。
　　方法:
　　siRNA干擾宮頸癌SiHa細胞中E2F1的表達，qRT-PCR檢測miR-424的表達情況?；瘜W合成miR-424基

16、因的轉錄起始位點上游2000bp序列，克隆到PGL3-Basic載體，再將miR-424啟動子區(qū)上E2F1的兩個識別位點分別進行逐一缺失突變和聯(lián)合缺失突變，雙熒光素酶報告基因檢測miR-424啟動子活性的改變。分別共轉染E2F1 siRNA和miR-424啟動子區(qū)、不同突變位點的miR-424啟動子區(qū)，檢測miR-424啟動子活性情況，明確E2F1對miR-424啟動子區(qū)具體位點的直接調控作用。采用染色質免疫共沉淀(ChIP)法，針對m

17、iR-424啟動子區(qū)E2F1的可能識別位點設計特異性引物，將免疫磁珠法富集抗體復合物后解聯(lián)釋放并純化的DNA片段進行普通RT-PCR驗證，再次明確E2F1對miR-424啟動子區(qū)特定位點的結合。
　　宮頸癌SiHa細胞高表達miR-424，qRT-PCR和western blot分別檢測Cul2mRNA和蛋白的表達水平，雙熒光素酶報告基因檢測聯(lián)合定點突變法確定miR-424對Cul2的直接靶向作用。SiHa細胞轉染Cul2 siR

18、NA和Cul2表達質粒，qRT-PCR檢測正反調控Cul2后miR-424的表達改變，western blot檢測E2F1的表達情況。構建HA標記的Cul2表達質粒，瞬時轉染293T工具細胞，收集蛋白進行免疫共沉淀(Co-IP)，驗證Cul2與E2F1的結合情況。SiHa細胞轉染E2F1 siRNA和E2F1表達質粒，進行western blot實驗，從正反兩方面驗證E2F1通過miR-424間接影響Cul2的表達。SiHa細胞轉染mi

19、R-424 mimic，qRT-PCR和western blot檢測E2F1mRNA和蛋白的表達水平，驗證miR-424通過調控Cul2間接影響E2F1的表達。
　　SiHa細胞分別轉染Cul2 siRNA、Cul2表達質粒、E2F1 siRNA和E2F1表達質粒，CCK8法和ki-67免疫熒光法檢測Cul2和E2F1對細胞增殖能力的影響，流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
　　結果:
　　1.SiHa細胞干擾E2F1的表

20、達可引起miR-424的表達上調，熒光素酶報告基因檢測和ChIP實驗結果顯示E2F1結合miR-424啟動子區(qū)的兩個E2F1識別位點直接抑制miR-424的啟動子活性。
　　2.SiHa細胞高表達miR-424促使Cul2 mRNA和蛋白表達均受抑制，熒光素酶報告基因顯示miR-424能直接靶向Cul23'UTR區(qū)。SiHa細胞正向或反向調控Cul2的表達，可反饋性引起miR-424出現(xiàn)下調或上調表達，而miR-424的上游分子E

21、2F1的表達水平與Cul2的表達同向改變。免疫共沉淀結果顯示Cul2能與E2F1結合。
　　3.SiHa細胞正向或反向調控E2F1的表達，Cul2蛋白表達出現(xiàn)同向改變。高表達miR-424可引起E2F1表達下降。
　　4.分別正反兩方面調控Cul2和E2F1的表達，Cul2和E2F1均能促進SiHa細胞的增殖能力，ki-67增殖標記分子表達增加，加速細胞周期從G1期過渡到S期。
　　結論:
　　1.E2F1是mi

22、R-424的直接上游分子，抑制miR-424的表達。
　　2.在宮頸癌細胞存在Cul2/E2F1/miR-424反饋環(huán)路，該環(huán)路的調控結果導致miR-424出現(xiàn)持續(xù)性表達抑制。
　　第四部分 miR-424-高危人乳頭瘤病毒16早期癌蛋白E7的關系探討
　　目的:
　　確定HPV16早期癌蛋白E7對miR-424的調控作用和機制。
　　方法:
　　采用qRT-PCR法檢測HPV陰性宮頸正常上皮組織、單

23、純HPV16感染的宮頸正常上皮組織、單純HPV16陽性CINⅡ-Ⅲ和單純HPV16陽性宮頸癌中的miR-424和HPV16 E7的表達，并分析兩者的組織相關性。SiHa細胞過表達miR-424，qRT-PCR檢測HPV16 E7的mRNA表達水平。SiHa細胞分別轉染HPV16 E7表達質粒和HPV16 E7 siRNA，qRT-PCR檢測調控HPV16 E7后miR-424的表達改變。
　　HA標記的HPV16E7表達質粒轉染2

24、93T工具細胞，免疫共沉淀檢測HA-E7與E2F1的結合情況。HA標記的HPV16E7表達質粒和Cul2表達質粒共轉染293T工具細胞，免疫共沉淀檢測HA-E7與Cul2的結合情況。SiHa細胞分別轉染HPV16E7表達質粒和HPV16 E7 siRNA，western blot檢測HPV16 E7對E2F1和Cul2的表達調控。
　　結果:
　　1.miR-424在HR-HPV陰性宮頸正常組織、單純HPV16感染宮頸正常組

25、織、單純HPV16感染CINⅡ-Ⅲ和單純HPV16感染宮頸癌組織中表達逐級下降，而HPV16 E7的表達隨著病變進展逐級增高，相關性分析結果顯示與miR-424的表達呈明顯負相關。
　　2.SiHa細胞高表達miR-424不能引起HPV16 E7的mRNA表達水平改變，相反，正向和反向調控HPV16 E7的表達，miR-424的表達水平出現(xiàn)相應的下降和上升。
　　3.HPV16 E7能與E2F1直接結合，并同向調控E2F1的