FSTL1在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、[背景]
　　腎細胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)是最常見的泌尿系惡性腫瘤之一。由于RCC對放化療不敏感，免疫治療的療效有限，靶向治療顯示出一定前景，但存在個體差異，因此晚期RCC患者和轉(zhuǎn)移的RCC患者預后差，五年生存率不到10％。以上究其根本原因是RCC的發(fā)生發(fā)展機制尚不明確。眾多證據(jù)表明，NF-κB炎癥信號通路在腎癌中處于持續(xù)激活狀態(tài)。我們前期應用Microarray的方法發(fā)現(xiàn)卵泡抑素樣蛋白1(Foll

2、istatin-like protein1，F(xiàn)STL1)可能與RCC轉(zhuǎn)移相關，且RCC中FSTL1的轉(zhuǎn)錄水平由癌旁正常組織、原位癌組織到轉(zhuǎn)移癌組織，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，提示其可能發(fā)揮抑癌基因的作用。FSTL1是一種由非免疫細胞表達分泌的炎癥相關蛋白。本研究擬結(jié)合宏觀人群研究和微觀分子水平兩方面，探討FSTL1基因的單核苷酸多態(tài)性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)、基因表達與RCC發(fā)生發(fā)展的關系及臨床意

3、義，由此為豐富RCC發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的治療靶點和預后標志物提供科學依據(jù)。
　　[材料與方法]
　　1.采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)和免疫組化的方法檢測FSTL1在腎癌細胞（786-O，ACHN及我室自行建立的漢族人腎癌細胞株NRCC）和95例臨床組織樣本中的表達分布特點，及其與腎癌腫瘤分期的相關性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，評價FSTL1蛋白表達在腎癌預后預測中的價值。
　　2.通過檢索

4、國際人類基因組單體型圖計劃，采用Haploview軟件搜索FSTL1相關的標簽SNP位點。采用流行病學病例對照研究方法、應用Taqman探針-實時定量PCR法對FSTL1相關SNP位點(rs11708686，rs2673704，rs1259293，rs1402372，rs1105219，rs1259339)在417例腎癌樣本和855例正常對照樣本中進行分型檢測，使用在線分析工具(http://ihg.gsf.de)檢驗任意SNP在對照組

5、中的基因分型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用Logistic回歸分析FSTL1相關SNP與腎癌發(fā)病的相關性，使用Kaplan-Meier分析FSTL1相關SNP的基因型與預后的關系。
　　3.構建FSTL1真核表達載體和特異性沉默F(xiàn)STL1的shRNA載體，轉(zhuǎn)染至腎癌細胞株(786-O、ACHN、NRCC)中，觀察過表達和沉默效果;通過軟瓊脂克隆實驗、Transwell細胞侵襲實驗、流式細胞術、RT-PCR等方法

6、考察FSTL1基因?qū)CC細胞表型和生物學行為的影響。
　　4.采用cDNA表達譜芯片分析NRCC中沉默F(xiàn)STL1后的基因表達變化，采用DIVID分析法和GSEA分析法分別對差異表達基因進行通路富集和功能預測，并采用RT-PCR、Western Blot、報告基因?qū)ι鲜鲱A測到的FSTL1參與的信號轉(zhuǎn)導途徑進行驗證。
　　5.體外模擬腫瘤炎性缺氧的微環(huán)境，通過RT-PCR、Western Blot對FSTL1下游相關通路間的交

7、互作用進行考察，尋找下游交叉節(jié)點分子。利用免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定，篩選介導相互作用的候選分子。
　　[結(jié)果]
　　1.與人正常胚胎腎上皮細胞293T相比，F(xiàn)STL1在腎癌細胞(ACHN、MRCC和NRCC)中低表達(p＜0.05)，在腎癌細胞786-O中高表達(p＜0.05)。免疫組化分析顯示FSTL1蛋白在癌組織中的表達水平顯著低于配對的癌旁正常組織(p＜0.001);癌組織中FSTL1蛋白表達量與腫瘤分期呈負相關(p=0.

8、013，r=-0.264)。腎癌組織中FSTL1表達為陰性的患者術后平均生存時間97.22個月，癌組織中FSTL1表達為陽性的腎癌患者術后平均生存時間115.84個月(Log-rank檢驗p=0.138)。
　　2.在正常對照組樣本中，六個基因多態(tài)性位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(p＞0.05)。以腎癌患者為病例組，攜帶rs1259293位點CC基因型者較TT基因型其腎癌發(fā)病風險升高(OR=2.004，95

9、％CI=1.190-3.375，p=0.009);以RCC的主要病例類型——腎透明細胞癌患者為病例組獲得相似結(jié)論(OR=2.014，95％CI=1.171-3.463，p=0.011)，提示rs1259293位點CC基因型為腎癌發(fā)生的危險因素。本研究中未發(fā)現(xiàn)rs11708686，rs1105219，rs1259339，rs1402372和rs2673704與RCC危險性之間的統(tǒng)計學關聯(lián)。攜帶rs1259293 TT/CT基因型的RCC患

10、者平均術后總生存期為129.17個月，顯著高于攜帶CC基因型的RCC患者的平均術后總生存期79.63個月(p=0.022)。
　　3.在穩(wěn)定沉默F(xiàn)STL1的NRCC細胞中，與對照NRCC shsiscramble細胞相比，NRCC shFSTL1-2的克隆形成能力、遷移侵襲能力顯著升高，NRCCshFSTL1-1/2的N-cadherin表達量顯著上升(p＜0.01)，E-cadherin表達量顯著下降(p＜0.01)。ACHN、

11、786-O也獲得相似的結(jié)論。NRCC中沉默F(xiàn)STL1后，G0/G1期細胞數(shù)減少，S期和G2/M期細胞數(shù)增多;細胞表面標志物CD99、N-cadherin、EpCAM表達增多，CD24表達減少。以上結(jié)果提示，過表達FSTL1能夠抑制腫瘤的生長、增殖，遷移和侵襲;沉默F(xiàn)STL1后能夠促進腎癌細胞生長，增殖，遷移和侵襲，促進細胞由G1期進入S期，RCC細胞粘附水平降低，啟動上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程。
　　4.Affymetrix Hu

12、man U133 Plus2.0表達譜芯片數(shù)據(jù)分析顯示，沉默F(xiàn)STL1表達后NRCC shFSTL1-1/2細胞中共有105個差異表達基因（48個共同表達下調(diào)和57個共同表達上調(diào)）。以富集錯判率小于25％為標準，應用GSEA軟件分析發(fā)現(xiàn)FSTL1沉默的NRCC細胞中共有12個功能基因亞集表達下調(diào)和23個功能基因亞集表達上調(diào)，包括TNFα、NF-κB、HIF1α和HIF2α相關功能基因亞集顯著性富集且上調(diào)表達。ACHN、786-O和NRC

13、C細胞沉默F(xiàn)STL1后IL-6和HIF1α的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升(p＜0.05); ACHN和786-O細胞中過表達FSTL1后，HIF1α的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(p＜0.05)，IL-6的轉(zhuǎn)錄水平未見顯著變化。Western blot結(jié)果顯示，TNFα刺激30分鐘時，與對照組NRCC shsiscramble相比，NRCC shFSTL1-1/2組細胞中Iκ-Bα表達量顯著降低，提示沉默F(xiàn)STL1表達后NF-κB信號通路活性升高。NF-κB報

14、告基因分析發(fā)現(xiàn)，在ACHN和786-O中沉默F(xiàn)STL1后，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性升高，而過表達FSTL1后，NF-κB轉(zhuǎn)錄活性降低，以上結(jié)果提示FSTL1可能通過抑制NF-κB信號途徑和HIF信號途徑發(fā)揮抑癌作用。
　　5.采用DFX和TNFα刺激模擬腫瘤生長的缺氧/炎性環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DFX刺激后，786-O和ACHN細胞中IL-6轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p＜0.05); TNFα刺激后，ACHN細胞中HIF通路下游基因PGK1表達水平升高

15、(p＜0.01)。Western blot檢測結(jié)果提示，加入DFX刺激后，ACHN、MRCC和NRCC細胞中Iκ-Bα表達量降低，NF-κB通路活性增強，加入TNFα后，786-O、ACHN和MRCC細胞中，HIF2α表達量升高，HIF信號途徑活性增強，并且無論單獨加入DFX或TNFα，或兩者共同處理細胞，786-O、MRCC和NRCC中pAkt和pGSK表達量均升高。以上結(jié)果提示，腎癌細胞中FSTL1的下游通路HIF和NF-κB信號途

16、徑存在交叉調(diào)節(jié)情況，均可激活PI3K信號通路。利用免疫共沉淀、質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)CDC24、TUBB、CCT3等分子可能參與HIF與NF-κB途徑的交互作用導致的PI3K通路活性增強。
　　[結(jié)論]
　　RCC患者癌組織中FSTL1的表達水平較癌旁正常組織顯著下調(diào)，且癌組織中FSTL1表達水平與病理分期呈負向相關。首次發(fā)現(xiàn)FSTL1基因rs1259293位點多態(tài)性與RCC發(fā)病有關，CC基因型為RCC發(fā)病的危險因素，且CC基因型與