抗白葉枯轉(zhuǎn)基因水稻的培育和利用表達(dá)譜芯片對(duì)水稻抗褐飛虱機(jī)制的研究.pdf

1、Part1:在水稻抗病蟲育種中，抗性基因資源是最重要的，但是在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用中，尤其是在現(xiàn)在的雜交育種中，與顯性性狀基因相比隱性的抗性資源往往難以利用。但是與顯性性狀相比，隱性基因可能賦予了作物對(duì)不同生理小種病原菌或不同生物型害蟲新的抗性機(jī)制。水稻抗白葉枯病隱性基因Xa13，同時(shí)也被證明參與了花藥的發(fā)育，目前已被克隆并且其抗性機(jī)制最近也已被解析。在本研究中我們希望將xa13基因隱性抗病的表型轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性表型，希望能借此促進(jìn)xa13基因在育

2、種中的應(yīng)用。我們通過(guò)使用人工小RNA沉默技術(shù)去干涉Xa13基因的表達(dá)，并且使用組織特異性的啟動(dòng)子（Osrbcsp和Atrbcsp）避免人工小RNA（amiA和amiB）在花藥中的表達(dá)，從而保證Xa13基因在花藥的發(fā)育過(guò)程中正常的行使功能。本實(shí)驗(yàn)最后得到了符合預(yù)期的高抗白葉枯且結(jié)實(shí)率正常的轉(zhuǎn)基因水稻，證明我們?cè)谵D(zhuǎn)基因植株中達(dá)到了特異性沉默Xa13基因的效果。本研究為如何在生產(chǎn)育種上利用xa13這種隱性且一因多效的基因提供了一個(gè)良好的思路。

3、
　　本實(shí)驗(yàn)研究成果如下:
　　1)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得明恢63轉(zhuǎn)基因T0代主要的4個(gè)片段分別得到PCR陽(yáng)性苗為31（Osrbcsp-amiB），27(Atrbscsp-amiA)，38（Osrbcsp-amiB和25(Atbcsp-amiB)。
　　2)接種白葉枯病菌PXO99兩周后，野生型明恢63病斑長(zhǎng)和病斑面積比例分別為22.75±2.12cm和88.5±7.0％。與此相比，表達(dá)amiB的轉(zhuǎn)基因片段

4、表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性，Osrbcsp+amiB和Atrbcsp+amiB分別有84.2％(32/38)和80.0％(20/25)的陽(yáng)性家系表現(xiàn)出了白葉枯抗性，甚至分別有50％(19)和32％(8)達(dá)到了高抗水平，即病斑長(zhǎng)度小于3 cm;但是轉(zhuǎn)amiA片段抗性效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于轉(zhuǎn)amiB的片段。
　　3)通過(guò)PAGE Northern實(shí)驗(yàn)得知，amiA和amiB都在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)。我們還進(jìn)行了Xa13基因的降解是否由于amiRNA介導(dǎo)的

5、5'RACE驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示amiB轉(zhuǎn)基因片段中分離的Xa13 mRNA的5'端序列的12個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果完全一致，顯示Xa13在與amiB互補(bǔ)序列的第10和11個(gè)堿基之間被切斷而降解。但amiA-Xa13由于太靠近3'端，而無(wú)法設(shè)計(jì)合適的RACE引物從而無(wú)法獲得amiA剪切位點(diǎn)的直接結(jié)果。
　　4)為了驗(yàn)證Atrbcsp和Osrbcsp的組織特異性，我們通過(guò)stem-loop primer特異性反轉(zhuǎn)錄了葉片和花藥中的amiRNA

6、，RT-PCR結(jié)果顯示花藥中amiRNA的表達(dá)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于葉片。我們進(jìn)一步進(jìn)行了qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示同一植株背景下，4個(gè)片段中的amiRNA在葉片中的表達(dá)量為花藥中的162倍至1211倍。
　　5)我們選取了兩個(gè)Osrbcsp+amiB單拷貝家系，在T1代苗期進(jìn)行了PXO99的接種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隱性抗性性狀已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)轱@性性狀，T1代符合3∶1孟德?tīng)柗蛛x比。潮霉素southern和amiB表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與抗性表型表現(xiàn)出完全的共

7、分離。
　　Part2:褐飛虱是水稻的主要害蟲之一，且不受Bt殺蟲蛋白的影響，因此，從水稻種質(zhì)資源中挖掘抗性基因?qū)τ诤诛w虱的防治至關(guān)重要。RH(Rathu Henatu)是來(lái)自于斯里蘭卡的秈稻品種，對(duì)褐飛虱所有生物型均有良好和持久的抗性。前人的研究在RH中至少定位了4個(gè)抗性QTL區(qū)間。我們以RH為研究材料，以敏感水稻品種TN1為對(duì)照親本，通過(guò)表達(dá)譜芯片技術(shù)嘗試分析RH具有廣譜持久抗性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，并確定了一批候選褐飛虱抗性相關(guān)

8、基因。結(jié)合芯片分析和前人定位的結(jié)果，在抗性QTL區(qū)間確定候選的抗性相關(guān)基因16個(gè);通過(guò)表達(dá)模式分析，在4個(gè)QTL區(qū)段外，利用表達(dá)模式篩選出候選褐飛虱抗性相關(guān)基因22個(gè)。已有研究表明植物激素JA和SA信號(hào)途徑在植物對(duì)害蟲的抗性互作中扮演重要角色。我們分析了RH和TN1在褐飛虱脅迫誘導(dǎo)條件下JA和SA相關(guān)合成和信號(hào)途徑基因的表達(dá)模式，以及測(cè)定了相應(yīng)RH和TN1體內(nèi)JA和SA濃度的變化。
　　本研究主要結(jié)果如下:
　　1)內(nèi)參基因

9、是準(zhǔn)確檢測(cè)基因表達(dá)量的一個(gè)重要決定因素，選擇褐飛虱取食條件下穩(wěn)定的內(nèi)參對(duì)于準(zhǔn)確檢測(cè)褐飛虱取食特異性誘導(dǎo)基因具有重要意義。我們提取了qRT-PCR檢測(cè)中常用的8個(gè)內(nèi)參基因在不同樣品中的原始信號(hào)值，比較得知TBP和ubiquitin比較適合用于褐飛虱脅迫條件下的基因表達(dá)檢測(cè)。本研究所有的qRT試驗(yàn)均選擇ubiquitin作為內(nèi)參基因。另外結(jié)合明恢63和珍汕97芯片結(jié)果我們也發(fā)掘了兩個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的新內(nèi)參基因Os.1321.1.S1_a和Os.1

10、45.1.S1_aat。
　　2)我們使用了Affymetrix的水稻芯片，共檢測(cè)了57194個(gè)探針的表達(dá)量。芯片檢測(cè)結(jié)果表明，在針刺處理下，RH出現(xiàn)表達(dá)差異的探針數(shù)量明顯少于TN1。在6h，RH中針刺差異探針為92，而TN1中為211，表明TN1比RH對(duì)于單純物理傷害反應(yīng)更劇烈。針刺處理24h后，RH表達(dá)差異的探針為27，TN1中為38，無(wú)論是RH還是TN1的基因表達(dá)波動(dòng)明顯恢復(fù)。
　　3)與針刺模擬的結(jié)果相反，接蟲6h，

11、RH中的差異探針數(shù)量(209)多于TN1(173)，且RH探針表達(dá)變化幅度較大(FC＞5)的探針數(shù)量為35，也明顯多于TN1中的12個(gè)。該結(jié)果表明，RH在褐飛虱為害初期被誘導(dǎo)表達(dá)的基因數(shù)量更多，對(duì)褐飛虱的反應(yīng)比TN1更迅速。接蟲24 h，RH中差異探針數(shù)上升到614，其中FC＞5的差異探針數(shù)由35上升至73;而TN1差異探針數(shù)上升到3356，其中FC＞5的差異探針數(shù)由12上升至349。
　　4)分別對(duì)6h和24 h時(shí)間點(diǎn)的RH和T

12、N1的針刺和接蟲處理的差異基因進(jìn)行韋恩圖分析，最終得到在RH特特異性表達(dá)，且褐飛虱特異性誘導(dǎo)的差異探針共192個(gè)，其中6h74個(gè)，24h152個(gè)。我們可以預(yù)期的是這192個(gè)RH中褐飛虱特異性誘導(dǎo)的基因中可能存在潛在的抗性相關(guān)基因。
　　5)為了解釋RH和TN1在接蟲條件下的差異基因在水稻抗蟲反應(yīng)中的功能，我們選取了T6N/T6C，T6P/T6C，T24P/T24C，R6N/R6C，R6P/R6C和R24P/24C六個(gè)組別的差異基因

13、用GOEAST進(jìn)行GO分析。GO分析結(jié)果分為BP(biology process)、CC(cellular component)和MF(molecular function)，在BP項(xiàng)目中無(wú)論是RH還是TN1中P值有顯著性差異的一級(jí)項(xiàng)目是response to stimulus和metabolic process，有顯著差異的是localization項(xiàng)目;在MF項(xiàng)目中，一級(jí)項(xiàng)目有極顯著差異的是catalytic activity，有顯

14、著差異的是binding和enzyme regulator activity;而CC項(xiàng)目中則無(wú)明顯特點(diǎn)。
　　6)芯片結(jié)果顯示茉莉酸(JA)途徑出現(xiàn)了17個(gè)差異基因表達(dá)模式，且都為上調(diào)，在RH和TN1中信號(hào)傳導(dǎo)途徑的差異基因都為JAZ類型的轉(zhuǎn)錄因子，他們是一類JA途徑的負(fù)調(diào)控因子，說(shuō)明褐飛虱為害可能抑制水稻的JA信號(hào)途徑;水楊酸(SA)途徑的差異基因全部出現(xiàn)在合成代謝途徑中，除了與乙烯(ET)途徑共有的一個(gè)基因出現(xiàn)下調(diào)外，其余5個(gè)

15、差異基因全部上調(diào);而乙烯合成途徑的基因則表現(xiàn)出了下調(diào)的。
　　7)我們測(cè)定了褐飛虱取食不同時(shí)間點(diǎn)(6h，24 h以及48 h)，RH和TN1體內(nèi)的SA和JA（游離態(tài)）的變化情況。結(jié)果表明，褐飛虱取食6h后，RH中SA表現(xiàn)出了明顯的上調(diào)，但TN1中SA激素水平的變化反應(yīng)相對(duì)滯后，24h后才出現(xiàn)一定的上調(diào)，該結(jié)果表明在褐飛虱取食誘導(dǎo)下RH中SA水平的變化比TN1更快，幅度也更大。相反的，JA含量在兩個(gè)品種中，自24 h開(kāi)始出現(xiàn)明顯下調(diào)