水稻抗白葉枯病相關(guān)基因OsCRK1的鑒定和克隆.pdf

1、由黃單胞桿菌引起的水稻白葉枯病是世界性水稻病害，嚴重制約水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。多年的實踐證明，種植抗病品種是防治該病最經(jīng)濟有效的途徑。雖然已經(jīng)鑒定出39個水稻抗白葉枯病基因，但被育種利用的并不多。因此挖掘和克隆新的抗白葉枯病基因是水稻抗病育種的客觀要求。轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)在新基因的發(fā)掘、代謝途徑確定、基因家族鑒定及進化分析等多方面顯示出極大的效力。我們從野生稻中挖掘出一個高抗白葉枯病資源，并培育出以IR24（感?。楸尘暗慕然?/p>

2、因系5024（抗?。?。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對這對近等基因系進行測序，通過測序結(jié)果分析、qRT-PCR驗證、RNAi干擾分析等手段獲得抗病相關(guān)基因。
　　獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.用國內(nèi)外25個白葉枯病代表菌系對近等基因系5024接種鑒定，結(jié)果5024對23個菌系表現(xiàn)高抗。與已知白葉枯病抗性基因比較抗譜，發(fā)現(xiàn)5024與其他基因的抗譜均不相同，抗譜上優(yōu)于Xa21，僅次于Xa23，表明5024可能含有新的抗白葉枯病基因

3、。
　　2.對用強致病菌PXO99(P6)注射接種處理的近等基因系IR24和5024進行轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得91022599和105644962條序列。通過測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)203個基因的表達有顯著差異，其中5024比IR24表達量上調(diào)的有114(56.2％)個，下調(diào)的有89(43.8％)個。并且差異表達顯著基因在第11染色體上的分布明顯多于其它染色體。
　　3.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在203個差異表達基因中有16個類抗病基因，

4、14個過氧化物代謝相關(guān)基因，6個抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，16個信號傳導(dǎo)相關(guān)基因。
　　4.對在5024中表達上調(diào)而在IR24中下調(diào)的6個基因（包括3個預(yù)測抗病相關(guān)基因，3個未知蛋白）進行RT-PCR與qRT-PCR分析，表達結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。其中的一個基因（編號ZW22，后命名為OsCRK1）在5024中表達量隨接種時間0d、1d和2d逐漸增高，而在IR24中檢測不到表達。表明OsCRK1與抗病相關(guān)，且受P6誘導(dǎo)表達。
　

5、　5.用長鏈PCR擴增出5024中OsCRK1基因的全長，經(jīng)測序分析OsCRK1基因編碼區(qū)長度為1371bp，編碼457個氨基酸，基因包含6個外顯子。
　　6.選擇OsCRK1基因3個外顯子片段，構(gòu)建RNAi表達載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化5024后獲得38株轉(zhuǎn)基因苗，用P6菌剪葉接種，14天后量取病斑長度，發(fā)現(xiàn)有10株表現(xiàn)感病，病斑長度平均在8.6cm，與感病對照IR24的病斑長度(9.3cm)相比無明顯差異，與抗病供體對照5024

6、的病斑長度(2.0cm)相比差異顯著。
　　7.將RNAi表達載體部分序列與OsCRK1基因內(nèi)部引物配對，對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR分子檢測，結(jié)果表明這些表現(xiàn)感病的植株都是由于RNAi干擾所致。
　　8.qRT-PCR進一步驗證了上述RNAi轉(zhuǎn)基因植株中OsCRK1表達量都顯著下降，其表達水平與IR24的相近。上述結(jié)果表明OsCRK1基因沉默后影響了水稻對白葉枯病的抗性，進一步證明該基因與白葉枯病抗性密切相關(guān)。