高糖高脂環(huán)境對骨髓和臍帶間充質(zhì)干細胞成骨分化功能的影響.pdf

1、目的:
　　模擬糖尿病患者的內(nèi)環(huán)境，觀察高糖高脂對人來源的骨髓間充質(zhì)干細(BMSCs)和臍帶間充質(zhì)干細胞(HUMSCs)增殖活性和成骨能力的影響，以期為組織工程方法促進糖尿病患者骨折愈合所需種子細胞的選擇提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞鑒定采用流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的表面抗原CD29、CD90和CD34、CD45的表達。高糖高脂環(huán)境對BMSCs和HUM

2、SCs增殖能力的影響采用CCK-8細胞活性檢測法。實驗共分4組，收集第5代的BMSCs和HUMSCs分別接種于4塊96孔板，A組:接種BMSCs，低糖細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。B組:接種BMSCs，高糖高脂完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。C組:接種HUMSCs，低糖細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。D組:接種HUMSCs，高糖高脂完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設35個復孔，每天隨機抽取5個復孔，連續(xù)測試7天。高糖高脂對BMSCs和HUMSCs的成骨分化能力的影響。實驗共分4組。A組

3、:BMSCs空白對照組采用傳統(tǒng)的成骨誘導培養(yǎng)基。B組:高糖高脂成骨誘導培養(yǎng)基作為BMSCs實驗組。C組:HUMSCs空白對照組采用傳統(tǒng)的成骨誘導培養(yǎng)基。D組:HUMSCs實驗組采用高糖高脂成骨誘導培養(yǎng)基。(1)觀察4組細胞成骨誘導前和成骨誘導3天，14天時的形態(tài)。(2)成骨誘導7天，應用堿性磷酸酶染色試劑盒對4組細胞進行染色。(3)成骨誘導21天，應用茜素紅對4組細胞進行染色。(4)成骨誘導15天，應用DBA染色試劑盒對4組細胞進行Ⅰ型

4、膠原蛋白染色。(5)應用細胞堿性磷酸酶(ALP)活性比色法定量檢測試劑盒，于成骨誘導第7、10、15天對4組細胞進行ALP的定量檢測。(6)成骨誘導21天，應用RT-RPC法對比各組骨鈣素基因的表達。
　　結果:
　　一:BMSCs和HUMSCs細胞形態(tài)及分子標志表達。(1)接種24小時后細胞貼壁，3天后多見梭形和多角形細胞，9天后長梭形細胞增多，相鄰集落融合。所觀察的細胞形態(tài)符合間充質(zhì)干細胞特征。(2)流式細胞儀檢測，本實

5、驗分離的骨髓間充質(zhì)干細胞表面表達CD29(99.8％)、CD90(100％);低表達CD34(1.4％)和CD45(0.2％)，符合間充質(zhì)干細胞的表面抗原特征。
　　二:培養(yǎng)環(huán)境對BMSCs和HUMSCs增殖能力的影響。C組細胞增殖最快，B、D兩組較慢，平臺期A、C兩組差值無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),A、C和B、D兩組的差值具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。B、D兩組的細胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，細胞收縮，排列無序。
　　三:高脂

6、高糖對BMSCs和HUMSCs誘導成骨分化的影響(1)4組細胞的ALP染色均呈陽性，但B、D兩組陽性較弱。(2)4組細胞茜素紅染色均呈陽性，但B、D兩組鈣結節(jié)數(shù)量較少，形態(tài)較小。(3)4組細胞的Ⅰ型膠原蛋白染色均呈陽性，但B、D兩組所染的棕黃色較淺。(4)4組細胞的ALP活性表達趨勢相同，均在成骨誘導第10天達到峰值，第15天明顯回落。但B、D兩組表達量較低，同A、C兩組的差值具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(5)4組細胞均表達骨鈣素基

7、因，其中A、C兩組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，B、D兩組表達量較低，同A、C兩組的差值具有統(tǒng)計學意義。(P＜0.05)
　　結論:
　　1.常規(guī)培養(yǎng)條件下HUMSCs的增值速度比BMSCs更快。2.在高糖高脂環(huán)境下，BMSCs和HUMSCs的增殖活性均降低，但無差異。3.高糖高脂環(huán)境下，BMSCs和HUMSCc雖然成骨分化的活力受損，但仍具有成骨能力。4.高糖高脂環(huán)境下，HUMSCs和BMSCs的成骨能力未見顯著區(qū)別。5.