十字花科黑腐病菌中十個(gè)小RNA的功能鑒定.pdf

1、細(xì)菌小RNA，也叫非編碼RNA，是一類(lèi)大小處于50～500 nt之間的RNA分子。細(xì)菌小RNA可以獨(dú)立地行使一些特定的功能，但是不具備編碼蛋白的能力，與核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA有明顯的差異。小RNA廣泛存在于各種生物中，對(duì)細(xì)胞的生理過(guò)程起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，它們作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在細(xì)菌的糖代謝、碳源代謝、群體感應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和致病性等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前，小RNA的鑒定工作以及對(duì)其功能進(jìn)行研究是當(dāng)前微生物學(xué)研究

2、領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)。目前，有效鑒定小RNA方法已經(jīng)成功建立，已經(jīng)成功鑒定了近1000個(gè)細(xì)菌小RNA，但是它們的生物學(xué)功能幾乎沒(méi)有被確定。小RNA在植物病原細(xì)菌致病過(guò)程中的作用和重要性仍然需要更深入的研究。
　　十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathovar campestris下文簡(jiǎn)稱(chēng)為Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的病原菌，它是研究病原菌與植物相互作用領(lǐng)域的一個(gè)極其重要的模式菌株。近來(lái)，本課題組

3、采用RNA深度測(cè)序(RNA-seq)方法，對(duì)Xcc8004菌株在MMX基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)表達(dá)的小RNA進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了500多個(gè)候選。但是這些候選小RNA的生物學(xué)功能仍不清楚。本研究選取了十個(gè)候選小RNA作為研究對(duì)象，首先采用三引物RT-PCR法確證它們的存在，然后分別構(gòu)建這十個(gè)候選小RNA的缺失突變體和過(guò)量表達(dá)株，然后對(duì)構(gòu)建成功的缺失突變體和過(guò)量表達(dá)株的相應(yīng)表型均進(jìn)行檢測(cè)和分析討論從而得知它們具有怎么的生物學(xué)功能。

4、>　　三引物RT-PCR結(jié)果分析得知這十個(gè)候選小RNA的確是真實(shí)存在的。然后，通過(guò)鏈特異性RT-PCR的方法，我們可以進(jìn)一步得知這十個(gè)小RNA的主要轉(zhuǎn)錄方向。目前，本研究已成功構(gòu)建了這10個(gè)目的小RNA的9個(gè)缺失突變體和10個(gè)過(guò)量表達(dá)菌株，然后，對(duì)成功構(gòu)建的所有缺失突變體和過(guò)量表達(dá)株均進(jìn)行了一系列的表型檢測(cè)，分別為:(1)在豐富培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)情況、(2)胞外多糖產(chǎn)量和胞外酶活性、(3)游動(dòng)性、(4)生物膜形成、(5)在非寄主

5、植物上引起的高敏反應(yīng)（HR反應(yīng)）、(6)在寄主植物上的致病能力等表型進(jìn)行了檢測(cè)，然后把檢測(cè)的所有表型與野生型菌株和帶有空的過(guò)量表達(dá)載體pBBad18K的野生型菌株的表型作出了相應(yīng)的比較和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)小RNA sRXcc-50的缺失突變體DM50在豐富培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)穩(wěn)定期的菌體密度小于野生型菌株;(2)小RNAsRXcc-49、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-55的缺失突變體DM49、DM51、DM52、DM55

6、在基本培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯小于野生型菌株;(3)小RNA sRXcc-53的過(guò)量表達(dá)株OE53在基本培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯低于對(duì)照組WT/pBBad18K;(4)小RNA sRXcc-55的過(guò)量表達(dá)株OE55在基本培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的菌體密度明顯高于對(duì)照組WT/pBBad18K;(5)小RNA sRXcc-49的缺失突變體DM49在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應(yīng)的時(shí)間比野生型Xcc8004早;(6)小RN

7、A sRXCC-52、sRXCC-55、sRXCC-56的過(guò)量表達(dá)株OE52、OE55、ROE56在辣椒葉片上出現(xiàn)HR反應(yīng)的時(shí)間比對(duì)照組WT/pBBad18K早;(7)其它的缺失突變體和過(guò)量表達(dá)株的所有表型檢測(cè)結(jié)果幾乎與對(duì)照菌株的完全一樣。
　　檢測(cè)結(jié)果表明:(1)小RNA sRXcc-49、sRXcc-50、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-53、sRXcc-55與Xcc的生長(zhǎng)有關(guān);(2)小RNA sRXcc-49

8、、sRXcc-52、sRXcc-55、sRXcc-56在Xcc8004的過(guò)敏反應(yīng)中可能起著重要的調(diào)控作用。
　　綜上所述，本工作驗(yàn)證了十個(gè)Xcc候選小RNA的存在，確定了它們的轉(zhuǎn)錄方向，并對(duì)它們的生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了六個(gè)小RNA(sRXcc-49、sRXcc-50、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-53、sRXcc-55)與生長(zhǎng)有關(guān)，四個(gè)（sRXcc-49、sRXcc-52、 sRXcc-55、sRXcc