擬南芥受十字花科黑腐病菌誘導的microRNA的鑒定.pdf

1、十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc)能在全球范圍內侵染十字花科植物，寄主包括甘藍、蘿卜、花椰菜、白菜、油菜、芥菜等作物以及模式生物擬南芥(Arabidopsis thanliana)，引起黑腐病。擬南芥和Xcc都是模式生物，二者的相互作用系統(tǒng)是研究病原細菌與寄主植物相互作用的致病分子機理的重要模式之一。
　　 長期以來，在對植物和病原菌的相互作用過程中的抗病機理的研

2、究中，人們注意力集中在對抗性蛋白的研究中。近年來，越來越多的證據表明內源性小RNA包括miRNA在植物防衛(wèi)病原微生物入侵的防衛(wèi)反應中發(fā)揮基礎性作用。目前在多個寄主與病原微生物相互作用過程中發(fā)現受病原微生物誘導的miRNA參與植物防衛(wèi)反應，這些病原微生物包括病毒、真菌、細菌、線蟲和植食性昆蟲。但是受病原細菌誘導的miRNA目前只在擬南芥-pst DC3000、煙草-根癌農桿菌、豆科植物-根瘤菌相互作用過程中發(fā)現，在其他植物與病原細菌的相互

3、作用中還沒有發(fā)現參與防衛(wèi)反應的miRNA，包括擬南芥與Xcc的互作過程中是否有miRNA參與，目前還未見報道。
　　 為了鑒定擬南芥中受十字花科黑腐病菌誘導的miRNAs，研究miRNAs在抗Xcc的防衛(wèi)反應中的作用，我們構建了擬南芥受十字花科黑腐病菌Xcc8004、Xcc8004△hrcV和丁香假單胞菌pst DC 3000誘導14小時和用無菌水作對照組的小RNA文庫，利用Illumina/Solexa測序技術對8個擬南芥小R

4、NA文庫進行測序，并對差異表達miRNA和新發(fā)現miRNA進行生物信息學分析。測序初步數據分析顯示ath-miR319a、ath-miR776、ath-miR172c、ath-miR827表達差異顯著，Northern blot驗證結果顯示ath-miR319a在對照組中只顯示很微弱的條帶，表達量較低，而受Xcc8004誘導14小時后的條帶的亮度明顯上升，表明其受誘導表達；但是受pst DC3000誘導14小時沒有條帶，說明其表達受ps

5、t DC3000抑制。相似的，ath-miR776在對照組中只顯示出微弱的條帶；受Xcc8004誘導14小時的條帶亮度明顯增加，表達也受誘導；受pst DC3000誘導14小時的條帶亮度和對照組基本沒有變化。目前對新發(fā)現小RNA的生物信息學分析得到311個具有典型二級結構前體的候選miRNA，其中126個為新發(fā)現候選miRNA。
　　 已有文獻報道，擬南芥miRNA生物合成途徑在對抗Pst DC3000的防衛(wèi)反應中發(fā)揮重要作用。

6、我們的實驗結果表明ath-miR319a、ath-miR776受Xcc誘導，它們的生物合成途徑是否在抗Xcc入侵的防衛(wèi)反應中發(fā)揮作用，是我們感興趣的問題。為了研究它們的生物合成途徑是否在抗Xcc中發(fā)揮作用，我們檢測了Xcc8004及其6個致病相關突變體Xcc8004△hrpG、Xcc8004△hrpX、Xcc8004△hrcV、Xcc8004△Zur、Xcc8004△rpf、Xcc8004△csrA在野生型擬南芥（生態(tài)型為col-0型）

7、以及15個擬南芥miRNA pathway相關作用元件蛋白突變體(dcl1-4、dcl2-1、dcl3-1、ago4-1t、ago6-2、ago7-1、ago10、ago5、ago2、ago9-4、hyl1、rdr6-11、rdr2-2、hen1、hen3)中的致病性差異。我們發(fā)現Xcc8004、Xcc8004△hrpG、Xcc8004△hrpX、Xcc8004△hrcV、Xcc8004△Zur、Xcc8004△rpfG和Xcc8004