針對TGF-β1腺病毒siRNA的制備及對模型大鼠肺間質纖維化的影響.pdf

1、肺纖維化是一組以肺間質彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，發(fā)病機制迄今尚不十分清楚，主要涉及到多種炎癥細胞、免疫細胞及其分泌的介質和細胞因子，在炎癥反應過程中出現免疫調節(jié)紊亂、氧自由基損傷、膠原代謝失衡等。早期病變基礎是急性肺泡炎，在肺泡炎形成過程中多種炎性細胞、免疫效應細胞活化，分泌大量細胞因子，某些細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)，它們在組織損傷和修復中發(fā)揮了重要的作用。因其病因復雜

2、，臨床上缺乏有效的治療手段，所以預后極差。疾病后期為大量的成纖維細胞的病理性增殖及細胞外基質的進行性聚集，逐步取代正常的肺組織結構，出現限制性通氣功能障礙、肺一氧化碳彌散量(DLco)降低，最終導致呼吸衰竭而死亡。近年來，肺間質纖維化疾病的發(fā)病率和病死率呈逐年遞增的趨勢，給患者及社會帶來了極大的危害。
　　 機體大多數組織和細胞都可以產生TGF-β1，如淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、粒細胞、血小板、氣道上皮細胞和成骨細胞等。TG

3、F-β1是一種多效性細胞因子，其生物學功能包括調控胚胎的發(fā)育、調節(jié)細胞的增殖和分化、調節(jié)免疫應答、減輕炎癥反應、參與組織的損傷修復和調節(jié)細胞外基質的產生和降解等。已有的研究結果顯示，在肺間質纖維化的形成及發(fā)展的過程中，TGF-β1水平顯著升高，經用糖皮質激素或抗TGF-β1治療后肺間質纖維化的病理程度明顯減輕；敲出TGF-β1基因可明顯減輕小鼠博來霉素誘導的肺纖維化。因此，TGF-β1被認為是肺間質纖維化形成和發(fā)展過程中的最關鍵的“開關

4、性”細胞因子。目前，TGF-β1在肺間質纖維化中的作用已被眾多實驗證實，通過阻斷TGF-β1的產生或抑制其生物活性能夠有效地抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，提示干擾TGF-β1可能是抗肺纖維化治療較為理想的手段。
　　 為了更進一步證實TGF-β1在大鼠肺間質纖維化模型中對疾病進展的延緩作用，本研究首次采用RNAi技術及動物實驗，對TGF-β1在肺間質纖維化中的作用進行了全面、系統(tǒng)的研究，得出如下結論：成功構建針對TGF-β1 siRN

5、A腺病毒表達載體并包裝得到腺病毒顆粒，并在細胞水平證實其干擾效果；然后用氣管內滴入博萊霉素的方法建立大鼠肺間質纖維化模型；通過鼻腔滴入TGF-β1siRNA腺病毒干預后，肺間質纖維化程度明顯減輕；干預后支氣管肺泡灌洗液及外周血中TGF-β1的表達水平不同。該研究旨在為以TGF-β1為靶點的肺間質纖維化的分子靶向治療提供新的思路和可行性的臨床依據。
　　 第一部分沉默TGF-β1基因表達的siRNA腺病毒制備及效果分析
　　

6、 方法：
　　 (1)TGF-β1的siRNA的特異性靶序列和無關對照序列的設計：依據GenBank中TGF-β1的基因(NM_000660)序列，使用Clontech公司的RNAi Designer軟件，設計出針對TGF-β1的siRNA的特異性靶序列和無關對照序列。
　　 (2)pSIREN-Shuttle-TGF-β1 siRNA的構建：將上述設計的序列在一定條件下退火，利用T4 DNA連接酶將退火產物與pSIR

7、EN-Shuttle載體連接，分別得到pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon載體。
　　 (3)siRNA表達盒的制備：利用PI-SceI/I-CeuI雙酶切pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon即獲得siRNA表達盒(siTGF和siCon)。
　　 (4)TGF-β1 siRNA重組腺病毒表達載體的構建和鑒定：分別將上述表達盒重組

8、入腺病毒載體pAdeno-X，構建重組腺病毒表達載體pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon。然后利用DNA測序證實插入序列。
　　 (5)腺病毒載體的包裝：利用Pac I酶切重組腺病毒質粒pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon，用LipofectamineTM2000將線性化的pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon轉染至HEK293細胞中，12～14d后，裂解細胞并收集

9、病毒上清，純化、測定病毒滴度后保存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　 (6)干擾效果的測定：將病毒上清感染肺腺癌A549細胞，于48h收集細胞，利用RT-PCR和Western blot方法檢測A549細胞中TGF-β1 mRNA和蛋白的表達。
　　 結果：
　　 (1)TGF-β1及對照發(fā)卡樣siRNA單鏈DNA寡核苷酸退火后，電泳可見明顯條帶，位于100bp以下，接近100bp，與設計完全一致。
　　 (2)成功

10、構建了pSIREN-Shuttle-TGF-β1 siRNA重組載體。
　　 (3)成功構建TpAdeno-X-TGF-β1 siRNA的表達載體。
　　 (4)RT-PCR結果顯示，siRNA干預1組和siRNA干預2組與空白對照組、空載體組、無關siRNA對照組相比TGF-β1mRNA的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，其中siRNA干預2組的沉默效果優(yōu)于siRNA干預1組，但差異無統(tǒng)計學意義，提示TGF-β1第2

11、019-2037位的編碼序列的沉默效果較好；空白對照組、無關siRNA對照組與空載體組間無明顯差異，TGF-β1mRNA的表達水平均較高。
　　 (5)Western blot結果顯示，空載體組、無關siRNA對照組、siRNA干預1組、siRNA干預2組與空白對照組相比，細胞中TGF-β1蛋白的表達水平均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學意義，其中，空載體組和無關siRNA對照組升高最明顯，此兩者比較無明顯差別；siRNA干預1組

12、和siRNA干預2組與空載體組和無關siRNA對照組相比，細胞中TGF-β1蛋白的表達水平略有降低，差異有統(tǒng)計學意義，其中，siRNA干預2組細胞中TGF-β1蛋白的表達水平下降較siRNA干預1組下降明顯。
　　 第二部分 TGF-β1 siRNA重組腺病毒干預大鼠肺間質纖維化模型的實驗研究
　　 方法：
　　 (1)實驗動物及分組：雄性SD大鼠75只(購自河南省實驗動物中心)，體重220g(220±20g)，

13、隨機分為4組：空白對照組(15只)、模型對照組(20只)、無關siRNA對照組(20只)和siRNA干預組(20只)。
　　 (2)大鼠腫間質纖維化模型的建立：用10％的水合氯醛(40mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下做頸部正中切口，經氣管軟骨環(huán)朝向心端插入注射器，模型對照組、無關siRNA對照組、siRNA干預組一次性緩慢注入含博萊霉素0.2-0.3ml的生理鹽水溶液，繼續(xù)注入0.3ml空氣，以便使藥液充分注入肺內，空白對照

14、組滴入等量的生理鹽水。注入后立即旋轉大鼠，使藥液在肺內均勻分部，切口縫合，常規(guī)消毒，待大鼠清醒后正常喂養(yǎng)。
　　 (3)TGF-β1 siRNA治療大鼠肺間質纖維化：24h后，空白對照組、模型對照組分別經鼻滴入100μl/鼠的生理鹽水，無關siRNA對照組、siRNA干預組分別滴入等量體積的重組腺病毒pAdeno-X-siCon和pAdeno-X-siTGF。分別于造模后第7、14、28d腹腔注射麻醉后，腹主動脈放血法處死大鼠，

15、進行取材，每次各組隨機處死5只，分別進行肺組織病理學形態(tài)觀察及分子生物學檢測。
　　 (4)TGF-β1 mRNA和蛋白的表達的檢測：利用RT-PCR和Western blot法檢測肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1mRNA和蛋白的表達，并采用免疫組化法檢測肺組織TGF-β1蛋白的表達。并采用ELISA法檢測肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的表達。
　　 (5)超氧化物歧化酶活性的測定：利用ELISA法檢測肺泡灌洗液和外

16、周血中超氧化物歧化酶(SOD)的表達水平。
　　 結果：
　　 (1)肺組織病理形態(tài)學觀察：空白對照組各觀察時間點肺組織均結構清晰，未見明顯的肺泡間隔纖維化增厚等變化。模型對照組及無關siRNA對照組病變基本相似，各觀察時間點均可見肺組織結構破壞，纖維化形成，其中第28d纖維化最為顯著，主要表現為肺泡間隔不同程度纖維化增厚并伴有大量炎性細胞浸潤。siRNA干預組處理后，各觀察時間點大鼠肺組織纖維化程度顯著較模型組及無關s

17、iRNA組輕，其中第28d纖維化減輕程度最為顯著。
　　 (2)免疫組化法觀察大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達：模型對照組與無關siRNA對照組在各觀察期肺組織中TGF-β1蛋白的表達量均無顯著性差異，同時二者都較空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；siRNA干預組第7d、14d肺組織中TGF-β1蛋白的表達量與空白對照組比較顯著升高，與模型對照組和無關siRNA對照組比較顯示降低，差異均有統(tǒng)計學意義；第28dTGF-β1蛋

18、白的表達量顯著低于模型對照組和無關siRNA對照組，但仍高于空白對照組，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 (3)肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA和蛋白的表達：模型對照組、無關siRNA對照組及siRNA干預組各期Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA和蛋白的表達量比空白對照組均有顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；siRNA干預組與模型對照組和無關siRNA對照組相比有所下降，差異有統(tǒng)計學意義；模型對照組與無關siRNA對照組各期相比

19、無明顯差別。
　　 (4)肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1和SOD的表達水平：肺泡灌洗液中，TGF-β1的表達水平，各觀察期模型對照組、無關siRNA對照組及siRNA干預組較空白對照組TGF-β1的含量有不同程度的升高；siRNA干預組與模型對照組、無關siRNA對照組相比有所降低；模型對照組與無關siRNA對照組相比無明顯差別。在外周血中，各期各組間相比TGF-β1和SOD的含量無明顯差別。
　　 結論：
　　

20、 (1)成功構建出TGF-β1 siRNA腺病毒表達載體，并鑒定了2條對TGF-β1表達具有明顯抑制作用的靶序列。
　　 (2)TGF-β1 siRNA腺病毒表達載體轉入肺腺癌A549細胞中能明顯抑制A549細胞中TGF-β1 mRNA和蛋白的表達。
　　 (3)TGF-β1 siRNA重組腺病毒載體可抑制博萊霉素所致大鼠肺間質纖維化肺組織中TGF-β1 mRNA、TGF-β1蛋白及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達。