GKLF基因對人胃癌細胞株SGC-7901生物學行為影響的實驗研究.pdf

1、第一部分GKLF、IKLF在胃癌組織和胃癌細胞株中的表達及意義
　　 目的：研究胃癌組織和胃癌細胞株中GKLF、IKLF的表達及臨床意義。方法：采用熒光實時定量PCR法檢測胃癌組織和胃癌細胞株中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表達，免疫組織化學法(IHC)檢測胃癌組織及其遠端正常胃組織中GKLF、IKLF蛋白的表達，Westernblot和免疫細胞化學法(ICC)檢測人正常胃上皮細胞株GES-1及胃癌細胞株MKN-28、SG

2、C-7901、BGC-823、HGC-27中GKLF、IKLF蛋白的表達。結果：胃癌組織中GKLFmRNA的相對表達量明顯低于遠端正常胃組織、IKLFmRNA的相對表達量明顯高于遠端正常胃組織(P<0.05）、胃癌組織中GKLFmRNA、IKLFmRNA的表達水平與組織分化程度無關，GKLF蛋白總陽性率顯著低于遠端正常胃組織、IKLF蛋白總陽性率顯著高于遠端正常胃組織(P<0.05），GKLF、IKLF蛋白表達與胃癌患者的年齡、性別、分

3、化程度、Lauren分型無關，與淋巴結是否有轉移及pTNM分期有關(P<0.05)；胃癌細胞株中GKLFmRNA和蛋白的相對表達量低于人正常胃上皮細胞株GES-1、IKLFmRNA和蛋白的相對表達量則高于細胞株GES-1(P<0.05)。結論：胃癌組織和胃癌細胞株中存在GKLF低表達、IKLF高表達，GKLF、IKLF在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用，檢測GKLF、IKLF的表達有助于判斷胃癌患者病情程度和預后。
　　 第二部分重

4、組質粒pcDNA3.1-GKLF的轉染及穩(wěn)定細胞株的建立
　　 目的：建立高表達GKLF的穩(wěn)定轉染細胞株，以進一步觀察其對人胃癌細胞株SGC-7901生物學行為的影響。方法：用脂質體轉染法將重組質粒pcDNA3.1-GKLF轉染人胃癌細胞株SGC-7901，通過G418篩選，建立穩(wěn)定轉染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細胞株，用熒光實時定量PCR法、Westernblot和ICC法檢測GKLFmRNA和蛋白的表達。結

5、果：建立了穩(wěn)定轉染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細胞株，成功地表達目的基因。結論：成功建立穩(wěn)定轉染的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF細胞株，為下一步探討GKLF基因對胃癌生物學行為影響的體內外實驗研究奠定基礎。
　　 第三部分GKLF基因轉染對人胃癌細胞株SGC-7901生物學行為影響的體外實驗研究
　　 目的：體外觀察外源性GKLF基因轉染對人胃癌細胞株SGC-7901增殖活性和侵襲力的影響，探

6、討GKLF在胃癌中的作用機制。方法：應用MTT法（四甲基偶氮唑藍比色法）、流式細胞儀、克隆形成實驗和體外細胞侵襲實驗分別研究GKLF基因轉染前、后人胃癌細胞株SGC-7901增殖和侵襲活性的變化。RT-PCR法、Westernblot法分別檢測GKLF基因轉染前、后人胃癌細胞株SGC-7901中細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、Ki-67、E-鈣粘附分子(E-cadherin)mRNA和蛋白的表達。結果：與SGC-7901組和SGC

7、7901-pcDNA3.1組相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組細胞生長速度減慢、細胞出現G0/G1期部分阻滯、克隆形成率低、細胞侵襲力明顯減弱(P<0.05）。SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組細胞CyclinD1、Ki-67、E-cadherinmRNA和蛋白的表達水平均低于SGC-7901組和SGC7901-pcDNA3.1組（P<0.05）。結論：GKLF基因可能通過下調CyclinD1、Ki-67、E-

8、cadherin的表達，而使人胃癌細胞株SGC-7901的增殖活性和侵襲力降低。
　　 第四部分GKLF基因轉染對人胃癌細胞株SGC-7901生物學行為影響的體內實驗研究
　　 目的：體內觀察外源性GKLF基因轉染對人胃癌裸鼠皮下移植瘤生長、轉移的影響，并探討GKLF在胃癌中的作用機制，從而為胃癌的基因治療提供新的思路。方法：選用36只BALB/C-nu/nu裸鼠進行體內實驗，分兩批進行。每批裸鼠18只，各隨機分為三組，

9、每組分別注射等量的SGC7901-pcDNA3.1-GKLF、SGC7901-pcDNA3.1和SGC-7901細胞(2×107個/200μl/只)。第一批，將細胞注射于每只裸鼠右脅腹前肢皮下，接種6周后處死裸鼠，觀察腫瘤生長狀況、成瘤潛伏期，IHC法檢測裸鼠皮下移植瘤組織內GKLF、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表達情況，測定皮下移植瘤組織中MVD值；同時用B超觀察皮下移植瘤大小、血流信號及腹腔內轉移情況。第二批，將細

10、胞經尾靜脈接種于裸鼠，接種6周后處死裸鼠，顯微鏡下觀察有無肺轉移。結果：與SGC-7901組和SGC7901-pcDNA3.1組相比，SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組成瘤潛伏期延長、皮下移植瘤體積和瘤重較小(P<0.05)，皮下移植瘤組織內GKLF蛋白表達升高、Ki-67、E-cadherin、VEGF蛋白表達均降低，微血管密度(MVD)值降低。B超顯示：SGC7901-pcDNA3.1-GKLF組皮下移植瘤較小，血流信號I