水貂生長激素真核重組質(zhì)粒構(gòu)建及其表達的研究.pdf

1、本試驗旨在研究水貂生長激素的克隆與表達，探索出批量生產(chǎn)的途徑和方法。試驗通過構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pPIC9K-mGH，轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115，利用含不同濃度G418(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)的YPD平板進一步篩選多拷貝重組子。將多拷貝重組子用BMGY富集菌株，并用BMMY誘導(dǎo)表達蛋白，每隔24h取樣一次并添加甲醇，使其終濃度為1％。將取得的菌樣，離心取上清，TCA濃縮并進行SDS-PAGE和We

2、stern blot檢測;通過構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pVAX1-mGH，利用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染到BHK-21細胞中，用最小致死量為300μg/ml的G418進行陽性細胞株的篩選，進行免疫細胞化學(xué)和ELISA檢測蛋白表達情況。本試驗還將陽性重組質(zhì)粒pVAX1-mGH注射到小鼠后肢的股四頭肌，分別于注射后5、10、20、40、60d眼球采血，ELISA檢測血清中mGH的含量，同時取注射部位的肌肉組織進行免疫組織化學(xué)檢測

3、。試驗結(jié)果如下:
　　 1.重組質(zhì)粒pPIC9K-mGH轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115中，經(jīng)含4.00 mg/mlG418的YPD平板篩選出高拷貝細胞株，用SDS-PAGE檢測mGH的表達。結(jié)果顯示，用1％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)3d后，目的蛋白的表達最多;Western blot鑒定表明目的蛋白在酵母中獲得了表達。
　　 2.重組質(zhì)粒pVAX1-mGH轉(zhuǎn)染到哺乳動物BHK-21細胞中，經(jīng)G418篩選出陽性細胞株，免疫組化檢測到目的