間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌靶向性及其生長影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.建立結(jié)腸癌的動(dòng)物模型，了解裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤的病理改變。
　　2.通過對(duì)大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化、標(biāo)記及鑒定，為 MSCs進(jìn)行裸鼠結(jié)腸癌模型干預(yù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3.通過輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞觀察裸鼠結(jié)腸癌組織中是否有間充質(zhì)干細(xì)胞，明確間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌組織的靶向作用及對(duì)結(jié)腸癌組織生長的影響作用。
　　方法：
　　1.采用裸鼠皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞株Hct116方法建立裸鼠

2、結(jié)腸癌皮下移植瘤模型：將對(duì)數(shù)生長期的Hct116細(xì)胞,用0.25％的胰酶消化,PBS液吹打,1000轉(zhuǎn)/分室溫下離心，10min,棄上清,重復(fù)上述步驟3次后,用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度至107/ml。細(xì)胞懸液搖勻后,用1 ml無菌注射器吸取細(xì)胞懸液0.2 ml(含2×106細(xì)胞)備用。消毒裸鼠右側(cè)腰部皮膚，將注射器內(nèi)細(xì)胞注射于右側(cè)腰部皮下。共注射20只。注射完畢后，連續(xù)觀察10天，待裸鼠右側(cè)腰部長出直徑大于5mm

3、的的皮下瘤，裸鼠結(jié)腸癌模型建立。將20只裸鼠裸鼠結(jié)腸癌模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，實(shí)驗(yàn)組10只，對(duì)照組10只。
　　2.采用全骨髓差異貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）：將大鼠斷頸處死，在75%的酒精溶液中浸泡5min后于無菌環(huán)境下迅速取出雙側(cè)下肢,浸入含有雙抗的 PBS液中,洗滌并去除肌肉及附著軟組織,固定分離出的下肢長骨，剪刀減去兩端，用DMEM培養(yǎng)液2.5ml沖洗長骨骨髓腔，沖洗2-3次。將沖洗下來的含間充質(zhì)干細(xì)胞的懸液

4、于1000rp m下離心5min，倒掉上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，并放于溫度37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細(xì)胞的生長情況。原代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶面積約80%-90%時(shí)1:2或1:3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。
　　3.將獲取的MSCs進(jìn)行傳代、增殖及純化。第3代MSCs用一種羰花青熒

5、光染料CM-DiI(Chlormethylbenzamido-1，1 dioctadecyl-3，3，3ˊ，3ˊ-tetramethylindocarbocyamine)進(jìn)行標(biāo)記，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)算標(biāo)記率。再將標(biāo)記的MSCs制成細(xì)胞懸液，濃度為1×106/ml，于Hc t116細(xì)胞注射至裸鼠皮下第10天，將裸鼠結(jié)腸癌模型實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠尾靜脈注射2ml含1×106個(gè)標(biāo)記的MSCs細(xì)胞懸液，對(duì)照組每只裸鼠尾靜脈注射2ml生理鹽水。觀察

6、移植瘤生長情況，每3-4天同時(shí)測(cè)量兩組移植瘤瘤長、短徑，計(jì)算瘤體積，描繪腫瘤生長曲線，于移植MSCs14天，安樂死裸鼠，取皮下移植瘤，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。將取下的腫瘤組織行快速冰凍病理切片，通過熒光顯微鏡觀察腫瘤組織切片中是否含發(fā)熒光的陽性細(xì)胞；其余腫瘤組織行HE染色普通病理切片檢查，顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1.裸鼠皮下注射結(jié)腸癌細(xì)胞株Hc t116后，于注射后第10天，裸鼠皮下均長出直徑大于5m

7、m的的皮下瘤。將結(jié)腸癌皮下移植瘤組織行病理切片HE染色可觀察到，移植瘤細(xì)胞為腺癌，癌細(xì)胞核大小不一，數(shù)量不等，存在多核瘤巨細(xì)胞，可見病理核分裂像，多彌漫呈片狀或巢狀，細(xì)胞內(nèi)充滿黏液樣分泌物。
　　2.原代接種24h后在顯微鏡觀察可見較多細(xì)胞貼壁，外觀呈紡錘形和多角形，3天之后細(xì)胞的數(shù)量開始增多，且形態(tài)發(fā)生變化呈成纖維細(xì)胞樣長梭形，9天之后細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶面積90％左右，此時(shí)細(xì)胞呈極性排列，集落呈漩渦狀。經(jīng)過多次換液以及2次傳代后，至

8、第3代時(shí)，細(xì)胞趨于純化，形態(tài)均一，呈膜狀鋪展。細(xì)胞表面標(biāo)記物經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD29陽性率為98.6%、CD90陽性率99.6%；而CD34、CD45為陰性，陽性率分別為0.56％、0.89%。
　　3.驗(yàn)組皮下移植瘤組織體積與對(duì)照組皮下移植瘤組織體積之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組瘤重與對(duì)照組瘤重之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組皮下瘤冰凍病理切片組織于熒光顯微鏡下觀察可見發(fā)紅色熒光C M-DiI陽性