螞蟥生長繁殖習性及其遺傳多樣性分子標記研究.pdf

1、藥材水蛭為螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman和柳葉螞蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥品，是常用的活血化瘀藥。目前心血管疾病給人類健康造成的危害已經(jīng)越來越大，并已成為人類死亡的第一殺手，而以水蛭為主要原料的中成藥產品有望成為這一頑癥的克星，并且其抗炎作用可在飼料添加劑中進行大力開發(fā)應用.因此水蛭已成為中西藥及飼料工業(yè)不可缺少的原料，且隨著

2、社會發(fā)展及其相關產品的開發(fā)，其需求量仍將快速增長，而野生資源卻日益枯竭致使供需矛盾非常突出.近幾年，水蛭已成為世界性的緊俏中藥材之一.1984年水蛭被列入動物保護國際紅皮書.保護現(xiàn)有的螞蟥野生資源已成當務之急，為此螞蟥種質資源亟待整理和評價，以便為螞蟥核心種質資源庫的建立提供有力保障. 本研究首先從螞蟥內臟結構、皮膚表皮細胞類型的分布等形態(tài)學研究開始，進一步研究了螞蟥的生理、生長、繁殖習性和藥材中農殘、重金屬的積累，并對不同炮制

3、品、不同種質的螞蟥的內在質量進行系統(tǒng)的評價.在對其生理、生長、繁殖習性研究的基礎上，收集了我國螞蟥分布區(qū)部分種質資源，同時引入4個水蛭H.nipponica種群作為參照，在分子水平分析了螞蟥遺傳多樣性，了解其群體遺傳結構和多態(tài)性水平，并進行了類群的劃分，為螞蟥和水蛭的資源保護利用策略和人工選育提供有力的理論依據(jù).其次，采用兩種方法開發(fā)了螞蟥的微衛(wèi)星序列，并分析了其特點，為SSR分子標記在螞蟥遺傳多樣性研究中的應用和螞蟥種質資源的鑒定奠定

4、了基礎.具體研究內容和結果如下： 1.螞蟥生長繁殖習性及藥材質量評價研究 (1)應用組織石蠟切片和顯微攝影方法，對螞蟥內臟器官，包括口、咽、食管、嗉囊、腸、直腸、側盲囊、精巢、儲精囊、輸精管、射精球、前列腺、皮膚等進行解剖觀察分析.明確了螞蟥的消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)器官和皮膚的組織結構和作用，皮膚黏液細胞的類型與分布，為進一步研究螞蟥的生長、繁殖習性和人工養(yǎng)殖及種質鑒別提供參考依據(jù). (2)應用呼吸室法研究了螞蟥的耗

5、氧率、耗氧量和窒息點.結果表明平均體重為10g的螞蟥，15～35℃變溫條件下耗氧率變化在0.049～0.094mg·g-1·h-1之間，耗氧量在0.44～0.67mg·p-1·h-1之間，窒息點為0.90～1.51mg·L-1，20℃條件下耗氧率為0.044～0.058mg·g-1·h-1，耗氧量為0.19～0.77mg·p-1·h-1，窒息點為1.40·1.57mg·L-1。說明螞蟥的耗氧率隨溫度的升高而上升，窒息點隨溫度的升高而降低

6、，體重與耗氧率呈負相關，與耗氧量呈正相關，白晝和夜晚耗氧率的差異不大. (3)研究了在不同溫度條件下不同體重螞蟥生長攝食情況，以及螞蟥在24h內的攝食規(guī)律.結果表明螞蟥生長的適宜溫度是15～25℃，其飽食量隨著體重增大和溫度的升高而增加，攝食率隨個體增大而降低，在24h之內螞蟥有兩個攝食高峰. (4)在不同溫度、體重條件下觀察了螞蟥產卵和孵化習性。結果表明，螞蟥產卵和孵化的最適溫度為25℃，產卵的最佳體重為20g左右；溫

7、度能影響螞蟥產卵前后的體重，而體重大小對產卵前后體重變化影響不明顯；當卵重在0.1～2.0g之間時與孵出量成正比，當卵重大于2.0g時孵出量反而有所下降。 (5)采用原子吸收分光光度計、原子熒光分光光度計和氣相色譜儀對螞蟥、基地土壤和養(yǎng)殖用水的重金屬與農藥殘留進行了比較分析.結果表明除螞蟥藥材中鉛超出國家現(xiàn)行有關標準外，螞蟥藥材、養(yǎng)殖基地土壤和養(yǎng)殖用水六六六、DDT和重金屬殘留各項指標均符合國家規(guī)定標準.建議今后在制訂國家有關標

8、準時，將類似螞蟥類等動物的安全限量單獨列出. (6)采用《藥典》一部(2005版)的方法測定了野生和人工養(yǎng)殖螞蟥不同炮制品的水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指標，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定了鐵、鋅、銅、鉻、鉛、鎘、汞等元素，比較了野生和人工養(yǎng)殖螞蟥不同炮制品的內在質量.結果表明，水分：人工養(yǎng)殖與野生炮制品兩者之間差異不顯著(P>0.05)；總灰分：滑石粉燙炮制品最高，與其它炮制品差異顯著(P<0.0

9、5)；酸不溶性灰分：滑石粉燙炮制品最高，與其他炮制品差異不顯著(P>0.05)；醇溶性浸出物：野生炮制品與人工養(yǎng)殖炮制品差異顯著(P<0.05)；抗凝血酶活性：野生和人工養(yǎng)殖生曬品均達到藥典標準，且二者之間差異不顯著(P>0.05)；人工養(yǎng)殖及野生螞蟥不同炮制品中除鉛超標外，其余金屬元素含量均符合國家標準。 (7)參考《藥典》一部(2005版)測定了不同種群螞蟥的水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性等指標，采用

10、高效液相色譜法測定了其黃嘌呤，次黃嘌呤.結果表明南京人工養(yǎng)殖種群在水分、醇溶性浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性、黃嘌呤、次黃嘌呤等成分上均相對高于其他種群。 2.利用分子標記技術分析我國螞蟥種質資源遺傳多樣性 (1)以全國螞蟥主要分布區(qū)的8個省15份種質225個樣本進行遺傳多樣性分析.利用RAPD標記技術分析，結果表明在物種水平上，多態(tài)位點百分率(PPL)為99.66％，Nei'S基因多樣性指數(shù)(He)為0，3

11、599.種群水平上的多態(tài)位點百分率在30.30％～56.06％之間，平均為44.14％，最高為安徽馬鞍山，其次為江蘇溧陽，最低為南京人工養(yǎng)殖。群體間遺傳分化系數(shù)(GST)為0.5539，種群間基因流(Nm)為0.4028。數(shù)據(jù)顯示種群間分化較大，種群內存在一定程度變異。聚類分析顯示，當相似系數(shù)為0.80時，可將15份材料分為8個類群，其中廣西桂林、廣東廣州、云南大理、安徽馬鞍山四個醫(yī)蛭種群與其它大部分螞蟥種群相似性較低. (2)

12、利用ISSR分子標記技術分析了螞蟥遺傳多樣性，結果表明，在物種水平上，PPL為99.56％，He為0，3490。種群水平上的PPL在25.00％～53.95％之間，平均為37.73％，最高為廣西桂林，其次為廣東廣州，最低為江蘇南京人工養(yǎng)殖.GST為0.5730，Nm為0.3727.結果也表明螞蟥種群間存在較高水平遺傳分化，種群內也存在一定的遺傳變異.聚類分析表明，當相似系數(shù)為0.78時，可將供試的15個螞蟥種群分為5個類群. (

13、3)SRAP標記是一種新型技術，本文分析SRAP標記在螞蟥遺傳多樣性研究上的適用性.結果表明在物種水平上，PPL為99.02％，He為0.3687.種群水平上PPL在31.69％～58.86％之間，平均為50.59％，最高為江西樂安，其次為江蘇溧陽，最低為江蘇南京人工養(yǎng)殖.GST為0.4699，Nm為0.5641.聚類分析顯示，當相似系數(shù)為0.82時，可將15個種群分為6個類群。將SRAP標記結果同RAPD和ISSR結果分析比較，認為該

14、新型標記可以用于螞蟥遺傳多樣性研究. (4)通過測定螞蟥核糖體ITS堿基序列，分析其特點，了解種內變異類型.結果得到我國螞蟥主要的14個種群14個樣本rDNA中的ITS完全序列.ITS長度為857～863bp.ITS堿基頻率差異顯著，ITS較為保守.根據(jù)兩者序列以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹，表明螞蟥種內至少存在3個變異類型。結合RAPD、ISSR和SRAP三種分子標記的研究結果，可將供試材料分為三個等級加以保護和利用. 3

15、.螞蟥微衛(wèi)星(SSR)的開發(fā) SSR標記具有共顯性特點，開發(fā)螞蟥微衛(wèi)星對于遺傳多樣性研究具有重要意義.通過分析評價兩種有代表性的SSR標記開發(fā)方法，為微衛(wèi)星開發(fā)方法的選擇提供參考信息。在現(xiàn)有方法基礎上提出螞蟥微衛(wèi)星序列開發(fā)的兩種策略. (1)根據(jù)鏈親和素磁珠和生物素特異結合的特性，將微衛(wèi)星探針5'端生物素化后與鏈親和素磁珠特異結合，用磁珠和探針的結合物與兩端連接已知序列人工接頭的螞蟥基因組DNA酶切片段雜交，洗脫未雜交

16、DNA片斷后，建立微衛(wèi)星文庫.以此為模板用人工接頭序列為引物進行PCR擴增，產物直接克隆，經(jīng)菌液PCR篩選后測序分析。 (2)將特異接頭連接到限制性內切酶消化的基因組DNA上，以此為模板用簡并引物抑制性PCR獲得SSR文庫，克隆后經(jīng)過兩次菌液PCR篩選進行測序分析.結果表明，這兩種方法可以快速、高效地開發(fā)出微衛(wèi)星序列. (3)結合前面從基因組DNA中已開發(fā)的微衛(wèi)星序列，分析了螞蟥SSR特點。結果發(fā)現(xiàn)二核苷酸重復類型在螞蟥