HPVL1多肽抗體檢測(cè)HPV感染能力及確證多肽抗血清中和HPV16能力實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題組前期的研究結(jié)果表明:由課題組發(fā)現(xiàn)并已成功申請(qǐng)專利的人乳頭瘤病毒(HPV)主要衣殼蛋白L1C-末端共同保守序列多肽,能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生的抗血清,對(duì)多種型別HPVL1具有交叉的免疫反應(yīng)性,并且對(duì)多種HPV型別具有檢測(cè)能力和一定的中和HPV病毒能力。本課題主要任務(wù)就是進(jìn)一步評(píng)價(jià)該多肽抗體檢測(cè)HPV感染能力和多肽抗血清中和HPV病毒能力情況,目的就是為HPV檢測(cè)試劑盒和HPV預(yù)防性疫苗的開(kāi)發(fā)、研究做理論基礎(chǔ)和前期工作。本課題的研究?jī)?nèi)容主要

2、包括以下兩大部分:
　　第一部分:HPVL1多肽抗體評(píng)價(jià)HPV感染檢測(cè)能力
　　目的:進(jìn)一步確證HPVL1多肽抗體是否具有檢測(cè)HPV感染能力,評(píng)估其檢測(cè)效價(jià)。方法:1)收集臨床宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,一式兩份;2)一份標(biāo)本采用商用的潮州“凱普HPV分型檢測(cè)試劑盒”進(jìn)行HPV型別鑒定,統(tǒng)計(jì)HPV感染的檢出率;3)對(duì)相同的另一份標(biāo)本以本課題組的HPVL1多肽抗血清為探針進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn),確定標(biāo)本中病毒L1蛋白的存在與

3、否,計(jì)算由本方法檢測(cè)HPV感染率;4)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,比較分析以上兩種檢查方法檢測(cè)HPV的能力效價(jià)。
　　結(jié)果:1)凱普試劑盒檢測(cè)308例臨床標(biāo)本,陰性256例,陰性率為83.11％;陽(yáng)性52例,陽(yáng)性率為16.89％。其中HPV6、18各2例, HPV11有4例,HPV16有11例, HPV31、33、39、59、66、68、CP8304各有1例,HPV52有5例, HPV53有3例, HPV58有6例,HPV混合型共有12例。H

4、PV感染的型別中,HPV16、52和HPV58感染的比率均較高,分別占總有感染標(biāo)本的20％、16％、14％。2)ELISA檢測(cè)308例臨床標(biāo)本,共檢出陽(yáng)性48例,陽(yáng)性率為15.58％,陰性標(biāo)本260例,陰性率為84.42％。3)凱普和ELISA兩種方法檢測(cè)HPV陽(yáng)性例數(shù),進(jìn)行t檢驗(yàn),兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4)52例凱普試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本中,ELISA檢測(cè)只有42例為陽(yáng)性,其中HPV11有2例,HPV16有1例

5、,HPV39、52、53、58、68各有1例,混合型有2例用ELISA方法檢測(cè)為陰性。凱普檢測(cè)256例陰性標(biāo)本中,ELISA檢測(cè)共有250例為陰性,陽(yáng)性例數(shù)6例。5)凱普和ELISA兩種方法檢測(cè)同時(shí)為陽(yáng)性的標(biāo)本有42例,同時(shí)為陰性的標(biāo)本有250例,凱普陽(yáng)性、ELISA陰性標(biāo)本10例,凱普陰性、ELISA陽(yáng)性標(biāo)本6例,結(jié)果進(jìn)行X2檢驗(yàn),兩種方法陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:1)用ELISA方法檢測(cè)HPVL1蛋白的表達(dá),能夠確定

6、是否有HPV的感染,與凱普HPV分型試劑盒檢測(cè)HPV感染具有相同的檢測(cè)效果;2)本課題組制備的HPVL1多肽抗體對(duì)多種型別HPVL1具有廣譜反應(yīng)能力和良好檢測(cè)能力。
　　第二部分:HPVL1多肽抗血清中和HPV16能力確證
　　目的:以HPV16作為研究的靶物質(zhì),判斷該序列多肽抗血清是否具有中和HPV病毒的作用,判斷是否具有針對(duì)HPV感染的免疫保護(hù)潛能,從而進(jìn)一步確證多肽血清中和能力的多樣性,為HPV疫苗的開(kāi)發(fā)、研究做理論基

7、礎(chǔ)。
　　方法:1)收集經(jīng)過(guò)臨床病理診斷的宮頸癌標(biāo)本,PCR法對(duì)其進(jìn)行HPV分型;2)通過(guò)對(duì)宮頸癌組織進(jìn)行勻漿、離心、濃縮,微孔濾膜過(guò)濾除菌后,提取HPV16病毒混懸液;3)將提取的病毒混懸液與倍比稀釋后的多肽抗血清共孵育中和后,感染單層培養(yǎng)的HaCat細(xì)胞,用PCR方法檢測(cè)感染后HaCat細(xì)胞中是否有HPV16-DNA的存在;4)用ELISA法檢測(cè)感染后HaCat細(xì)胞HPVL1蛋白的表達(dá)差異情況,判定HPV L1多肽抗血清是否可

8、以阻斷HPV16對(duì)HaCat上皮細(xì)胞的感染,從而間接反應(yīng)多肽抗血清中和HPV16的能力。
　　結(jié)果:1)提取宮頸癌病變組織細(xì)胞的DNA,進(jìn)行PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳,在凝膠206bp處(HPV16特異性區(qū)間)呈陽(yáng)性條帶;2)粗提的HPV病毒感染正常的HaCat細(xì)胞,其細(xì)胞DNA提取物的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳,在凝膠206bp處呈陽(yáng)性條帶;3)HPV病毒與不同稀釋濃度的多肽抗血清中和后感染HaCat細(xì)胞,提取細(xì)胞的蛋白進(jìn)行ELISA檢測(cè)HPVL1