ATRX-C抗體的制備及在HPV16陽性宮頸癌組織中的初步應用.pdf

1、[目的]研制和初步評價ATRX-C抗體；分析ATRX蛋白在THP-1細胞中的定位及ATRX在人乳頭瘤病毒16型（HPV16）陽性宮頸癌組織中的表達和定位，為深入探討ATRX蛋白在HPV16所致宮頸癌中的作用及機制奠定基礎。
　　[方法]設計 ATRX C端基因片段(2193-2492氨基酸)引物，利用PCR擴增目的片段，雙酶切后連接表達載體 pET30a，經(jīng) PCR、酶切、測序分析，構建原核表達載體pET30a/ATRX-C219

2、3-2492；將質粒 pET30a/ATRX-C2193-2492轉化 E.coli BL21，IPTG誘導表達，利用鎳離子親和層析法純化6His-ATRX-C2193-2492蛋白，利用Western blot檢測純化產(chǎn)物6His-ATRX-C2193-2492；將純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白以皮下多點注射和腹腔注射方式免疫接種6只8周齡雌性BALB/c小鼠。初次免疫3周后，再免疫1次；第4、5周后分別再加強1

3、次，共免疫接種4次。每次免疫前及末次免疫后7天取血，ELISA測定抗體效價。飽和硫酸銨鹽析沉淀法初步純化抗血清，并用Western blot檢測之；利用間接免疫熒光檢測Daxx和ATRX在THP-1細胞株中的分布與定位；收集正常宮頸組織細胞、HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、原位癌和浸潤型宮頸癌組織標本，通過免疫組化技術檢測宮頸組織中ATRX的分布和定位以及表達量；利用Western blot檢測正常宮頸組織，HPV16陽性的宮

4、頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）、原位癌和浸潤型宮頸癌組織細胞中ATRX的表達量。
　　[結果]經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定，成功構建 pET30a/ATRX-C2193-2492原核表達載體；表達載體pET30a/ATRX-C2193-2492在 E.coli中誘導表達分子量約34kDa產(chǎn)物，且該產(chǎn)物能與ATRX抗體發(fā)生反應，并且純化得到目的產(chǎn)物；利用純化后的6His-ATRX-C2193-2492蛋白免疫小鼠，制備的抗ATRX-C2193

5、-2492多克隆抗體，其效價為1:12800；在THP-1細胞中，ATRX顯綠色信號和Daxx顯紅色信號，兩種信號都定位于細胞核，融合時出現(xiàn)黃色信號；ATRX在正常宮頸組織細胞具有較高表達并主要定位在細胞核；在 HPV16陽性的宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織細胞的表達與正常細胞類似；在原位癌組織細胞中表達量姣 CIN中減低，主要定位在細胞核和細胞漿；在浸潤型宮頸癌組織細胞中表達量降低，主要定位在細胞漿，細胞核中表達量明顯減少。