血瘀證模型的相關蛋白質組學研究.pdf

1、本課題在前期建立穩(wěn)定的氣滯和氣虛血瘀證大鼠、痰瘀互結證冠心病小型豬模型基礎上,應用雙向凝膠電泳(2-DE)、基質輔助激光解析-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)等先進的蛋白質組學技術方法,對正常和氣滯血瘀、氣虛血瘀及痰瘀互結證冠心病三種不同血瘀證模型動物的血清、心臟血管和心肌組織分別進行蛋白提取、分離及鑒定,利用比較蛋白組學研究方法,尋找與血瘀證形成相關的特異表達蛋白質,以期獲得潛在的血瘀證的診斷標記和治療靶標,進一步揭示血瘀證發(fā)

2、生、發(fā)展過程中的分子生物學基礎。
　　 第一部分氣滯血瘀證模型大鼠血清蛋白質組學初步研究
　　 正常組、氣滯血瘀證模型組大鼠各10只,將每組大鼠的血清混合,去除血清白蛋白。應用pH4-7,長24cm的IPG膠條進行等電聚焦電泳,為保證重復性,每組分別進行3次雙向電泳。利用Image Master2D Elite6.01分析軟件對正常組和模型組大鼠的血清蛋白質表達譜進行差異比較。實驗結果顯示:在相同條件下,模型組和正常組平

3、均檢測出347±37、354±20個蛋白點；選擇好參照膠后,將其他凝膠與參照膠相匹配,平均匹配上的蛋白點數(shù)為280±23,匹配率為75.3％；找出蛋白體積百分比值(％Vol)差異大于兩倍以上的蛋白點,發(fā)現(xiàn)氣滯血瘀證大鼠血清與正常組相比共有7個差異蛋白點,其中1個蛋白質下調,5個蛋白質上調,1個蛋白表達缺失。
　　 從制備膠中挖取這些差異蛋白點進行膠內酶解,酶解后的肽段用MALDI-TOF-MS分析,所得m/z數(shù)據(jù)送入NCBI非冗

4、余數(shù)據(jù)庫,通過MASCOT搜索引擎檢索,檢索分值在71分以上視為可信結果。檢索出Isovaleryl-Coa Dehydrogenase、STAT3-interacting protein2個蛋白,其中Isovaleryl-Coa Dehydrogenase下調,STAT3-interacting protein上調。STAT3-interacting protein與細胞因子的信號轉導通路密切相關,它們在氣滯血瘀證的形成中所起的作用有

5、待于進一步研究。
　　 第二部分氣虛血瘀證模型大鼠血清蛋白質組學初步研究
　　 正常大鼠和氣虛血瘀證大鼠各10只,利用2-DE圖譜分析軟件對正常組和模型組的血清蛋白表達譜進行差異分析,實驗結果表明:氣虛血瘀證模型組平均檢測出413±13個蛋白點,而正常組平均檢測出401±37個蛋白點；與參照膠相匹配,平均匹配上的蛋白點數(shù)為368±12,匹配率為88.5％；選出蛋白％Vol值差異大于2倍以上的蛋白點,發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證大鼠血清

6、與正常組相比共有7個差異蛋白點,其中1個蛋白質下調,5個蛋白質上調,1個蛋白表達缺失。
　　 經(jīng)質譜分析及MASCOT檢索,鑒定出CD5 antigen-like、haptoglobin、complementcomponent C3等6個蛋白,其中1個蛋白下調,5個蛋白上調,這些蛋白的功能與炎癥反應、免疫調控等病理過程相關,與已知的氣虛血瘀證的發(fā)生、發(fā)展過程基本相符。
　　 第三部分小型豬痰瘀互結證冠心病的蛋白質組學研究

7、
　　 正常組和模型組小型豬各6只,通過高脂飼料喂養(yǎng)結合球囊拉傷在小型豬體內建立冠心病痰瘀互結模型。血清、冠狀動脈和心肌組織總蛋白均進行雙向電泳分離,每種樣品分別進行3次雙向電泳以保證重復性。利用Image Master2D Elite6.01分析軟件對正常組和模型組的蛋白質表達譜進行差異分析。在相同分析條件下,3組樣品實驗結果分別如下:
　　 1、血清樣品2-DE圖中,模型組和正常組分別平均檢測出394±23、440±

8、25個蛋白點；與參照膠平均匹配上的蛋白點數(shù)為363±25,平均匹配率為82.8％；痰瘀互結證冠心病小型豬血清與正常組相比共有17個差異蛋白點,6個上調點,1個下調點,7個缺失點,3個特異表達的點。
　　 2、冠狀動脈樣品2-DE圖中,模型組平均檢測出1098±37個蛋白點,而正常組平均檢測出967±44個蛋白點；與參照膠平均匹配上的蛋白點數(shù)為895±45,平均匹配率為86％。痰瘀互結證冠心病小型豬冠狀動脈與正常組相比共有蛋白差異

9、點35個,14個上調點,17個特異表達點,另外模型組中有4個點發(fā)生未知修飾變化。
　　 3、心肌組織樣品2-DE圖中,模型組、正常組平均檢測出978±32和890±38個蛋白點；平均匹配上的蛋白點數(shù)為725±43,匹配率為76.7％；痰瘀互結證冠心病小型豬心肌組織與正常組相比共有14個差異蛋白點,13個上調點,1個特異表達點。
　　 經(jīng)質譜分析及MASCOT檢索,血清樣品鑒定出complement component4

10、bindingprotein、apolipoprotein E precursor等3個蛋白；冠狀動脈組織鑒定出transgelin、coactosin-like1等17個蛋白；心肌組織鑒定出HSPA8 protein、apolipoprotein A-Ⅳ等9個蛋白。以上鑒定出來的蛋白有半數(shù)是Albumin,部分蛋白質與炎癥反應、血管重構、脂質代謝等病理過程相關,推測這些蛋白可能與痰瘀互結證冠心病的發(fā)生、發(fā)展相關。
　　 結論<

11、br>　　 1、氣滯血瘀證和氣虛血瘀證大鼠的血清與正常健康大鼠相比,蛋白表達譜存在明顯的差異,表明多種差異蛋白參與上述兩種證候的發(fā)生發(fā)展。氣滯血瘀證和氣虛血瘀證大鼠血清分別鑒定出與這兩種證候的實質相關的2個和6個差異蛋白,分別是STAT3-interacting protein、haptoglobin、ZN-alpha-2-glycoprotein等,這些蛋白的功能與炎癥反應、免疫調控等病理過程相關。
　　 2、與正常健康小型

12、豬相應組織比較,痰瘀互結證冠心病小型豬的血清、冠狀動脈和心肌組織的蛋白表達譜均有明顯差異,3種不同樣品共鑒定出的30個差異表達蛋白質,分別是complement component4 binding protein、transgelin、coactosin-like1、HSPA8protein、apolipoprotein A-Ⅳ等,其參與了痰瘀互結證冠心病炎癥反應、血管重構、脂質代謝等病理過程。
　　 3、上述不同證候模型蛋白