用腫瘤細胞原代培養(yǎng)和人全基因芯片技術(shù)篩選鼻咽癌差異表達基因.pdf

1、目的:本研究采用寡核苷酸探針基因芯片技術(shù)，結(jié)合腫瘤細胞原代培養(yǎng)技術(shù)，研究鼻咽癌基因表達譜差異基因，并對鼻咽癌的發(fā)病機制進行初步探討。為鼻咽癌的早期診斷、預(yù)后判斷及治療方案的選擇提供理論依據(jù)。 方法:取鼻咽癌和鼻咽慢性炎癥的新鮮組織進行原代培養(yǎng)，對所獲得的細胞分別用細胞角蛋白(CK)免疫細胞化學(xué)、EBER1原位雜交、EBV-DNA熒光定量PCR等方法驗證。抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)雙色熒光標記后和人全基因表達譜芯片雜交

2、，構(gòu)建鼻咽癌原代細胞的全基因表達譜，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析數(shù)據(jù)，確定鼻咽癌差異表達基因。 結(jié)果:1鼻咽癌細胞差異表達基因篩選①經(jīng)原代培養(yǎng)后獲得5例鼻咽癌細胞和3鼻咽正常上皮細胞，上述原代細胞及鼻咽癌細胞株C666的總RNA提取和質(zhì)檢結(jié)果理想。6組芯片雜交結(jié)果顯示，所有陽性對照(管家基因)的雜交信號清晰，陰性對照的雜交信號很低，提示芯片雜交效果良好。 ②根據(jù)顯著性差異標準(ratio＞2，為基因表達上調(diào)；ratio＜0.5

3、，為基因表達下調(diào))，四例以上共同表達的差異基因有493個，包括上調(diào)基因264個，下調(diào)基因229個。對其中四例(NPC31、NPC43、NPC47和C666，經(jīng)聚類分析表達譜相似的)鼻咽癌細胞進行初步篩選，其中3例以上符合上述標準的差異表達基因共有636個，包括上調(diào)基因394個，下調(diào)基因242個。該636個基因中，包括細胞周期相關(guān)基因81個；細胞粘連蛋白15個；凋亡相關(guān)基因10個；分化相關(guān)基因4個；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因50個；轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因

4、25個；代謝相關(guān)基因25個；細胞運動相關(guān)基因7個；發(fā)育相關(guān)基因34個；逆境反應(yīng)蛋白34個；細胞組織與生物發(fā)生相關(guān)基因23個等。 2熒光定量PCR驗證差異基因①表達譜芯片中篩選出的4個表達上調(diào)基因ANLN、CENPF、MCM2和CDC6，在NPC43和NPC47熒光信號值Cy3/Cy5(ratio)，分別為43.8和84.4，28.4和68.7，3.1和3.4，2.5和2.9。熒光定量PCR檢測NPC43和NPC47的表達差異倍數(shù)

5、分別為25.3和77.7，12.7和71.4，7.5和4，5.1和4.9，兩種技術(shù)檢測的結(jié)果基本相符，即該4個基因在鼻咽癌原代細胞的表達比在正常細胞的表達顯著升高。同時，檢測CNE-1和SUNE-1中該4個基因的表達，基因差異倍數(shù)分別為：64.9和222，187和110，2.16和2.3，7.8和2.1，與表達譜芯片檢測的該4個基因的表達趨勢相同，在鼻咽癌細胞中表達上調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果也證明了，ANLN、CENPF、MCM2和CDC

6、6在鼻咽癌的原代細胞及細胞株中表達上調(diào)，為高表達基因。 ②表達譜芯片中篩選出的4個表達下調(diào)基因TGM3、NDRG1、SERPINB13和MAL，在NPC43和NPC47熒光信號值Cy3/Cy5(ratio)的倒數(shù)，即正常細胞和鼻咽癌細胞的差異倍數(shù)，分別為4.9和4.1，3.3和19.5，10和4.7，31.1和146.1。熒光定量PCR檢測正常細胞和鼻咽癌原代細胞NPC43和NPC47的表達差異倍數(shù)分別為13和4.3，2.5和1

7、2.4，23.9和2.6，2.2和54.4，兩種技術(shù)檢測的結(jié)果趨勢相同，即該4個基因在正常鼻咽上皮細胞的表達比在鼻咽癌原代細胞的表達顯著增高；同時，檢測CNE-1和SUNE-1中該4個基因的表達，結(jié)果示：正常鼻咽上皮細胞與鼻咽癌細胞株的基因差異倍數(shù)分別為：45.8和24.4，4.8和6.4，65.4和2.3，12.5和10.1，與表達譜芯片檢測的該4個基因的表達趨勢相同，在鼻咽癌細胞中表達下調(diào)。熒光定量PCR結(jié)果也證明了，TGM3、ND

8、RG1、SERPINB13和MAL在鼻咽癌的原代細胞及細胞株中表達下調(diào)，為低表達基因。 3免疫組織化學(xué)染色驗證差異基因的表達MCM2和CDC6在鼻咽癌組織中存在表達，陽性細胞表達分別定位于腫瘤細胞胞核和腫瘤細胞的胞漿及胞膜。對50例鼻咽癌組織和20例鼻咽慢性炎癥組織進行免疫組織化學(xué)分析，其中，MCM2在鼻咽癌組織和慢性炎癥組織中的陽性率分別為94％(47/50)和60％(12/20)；CDC6在鼻咽癌組織和慢性炎癥組織中的陽性率

9、分別為90％(45/50)和45％(7/20)。兩種組織中的表達存在顯著性差異(P＜0.001)，即MCM2和CDC6在鼻咽癌組織中均為高表達。 結(jié)論:1鼻咽癌細胞存在廣泛的差異表達基因，這些基因包括細胞周期相關(guān)基因、細胞粘連蛋白、凋亡相關(guān)基因、分化相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)、代謝相關(guān)基因、細胞運動相關(guān)基因、發(fā)育相關(guān)基因、逆境反應(yīng)蛋白、細胞組織與生物發(fā)生相關(guān)基因等。 2鼻咽癌細胞中ANLN、CENPF、MC