負(fù)載HBeAg的樹突狀細(xì)胞功能及抗乙肝病毒作用的研究.pdf

1、目的： ①通過檢測外周血來源的樹突狀細(xì)胞(DC)功能，比較免疫耐受期患者和低或非復(fù)制期患者的DC功能是否存在差異，以探討乙型肝炎病毒(HBV)感染者乙肝e抗原(HBeAg)血清轉(zhuǎn)換與DC功能的關(guān)系； ②研究體外負(fù)載HBeAg能否促進(jìn)DC成熟，增強(qiáng)DC功能；③觀察DC經(jīng)HBeAg刺激，體外誘導(dǎo)特異性T淋巴細(xì)胞后，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HBV mRNA表達(dá)及蛋白合成的影響。 方法： 1、收集免疫耐受期患

2、者11例、低或非復(fù)制期患者13例，另外選擇10例各型肝炎病原學(xué)標(biāo)志檢測均為陰性的健康體檢者為正常對(duì)照組，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，體外添加thGM-CSF、rhIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，分為兩組，分別加或不加HBeAg體外刺激，然后用thTNF-α促成熟，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子CD80、CD86和HLA-DR的表達(dá)量，CCK-8法檢測DC在同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力，酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗(yàn)(ELISA)檢測IL-12的分泌量。 2、自正常人PBMC中誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，經(jīng)不同濃度的HBeAg負(fù)載后與自身T淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生HBeAg特異性T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)與無HBeAg刺激的DC共同培養(yǎng)的T細(xì)胞、單純T細(xì)胞為對(duì)照組，作用于HepG2.2.15細(xì)胞系，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)的mRNA水平，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清

4、中HBsAg和HBeAg水平。 結(jié)果： 1、體外用含rhGM-CSF和thIL-4的RPMI-1640完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)人的PBMC，可見貼壁細(xì)胞逐漸懸浮，并呈細(xì)胞積聚現(xiàn)象，形態(tài)不規(guī)則呈樹突樣突起；收集第9天的懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)達(dá)2.0×106/10ml外周血，經(jīng)掃描電鏡觀察可見細(xì)胞表面有大量的皺褶及細(xì)而長的刺狀突起，流式檢測DC純度達(dá)80％以上，且高表達(dá)CD86、CD80、HLA-DR，具有典型的DC特異性標(biāo)志。

5、 2、對(duì)11例免疫耐受期患者、13例低或非復(fù)制期患者和10例正常人外周血來源DC的成熟度和功能檢測發(fā)現(xiàn)：①免疫耐受期患者DC表面CD80、CD86、HLA-DR的表達(dá)量顯著低于低或非復(fù)制期患者和正常人(P<0.05)，但低或非復(fù)制期患者和正常人組的DC表面的3個(gè)分子表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；②當(dāng)DC/T比值為1：5、1：10時(shí)，免疫耐受期患者DC刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著低于低或非復(fù)制期患者和正常人(P<0.05)，而低或非

6、復(fù)制期患者和正常人組無明顯差異(P>0.05)；③ELISA檢測MLR中DC分泌IL-12 p70的水平，發(fā)現(xiàn)免疫耐受期患者IL-12p70的含量明顯低于低或非復(fù)制期患者和正常人(P<0.05)，而低或非復(fù)制期患者與正常組無明顯差異(P>0.05)。 3、將培養(yǎng)至第6天的DC經(jīng)HBeAg刺激24小時(shí)后檢測發(fā)現(xiàn)：①光鏡觀察HBeAg刺激組和對(duì)照組的DC形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)；②流式細(xì)胞儀分析顯示，HBeAg刺激組

7、的DC表面分子表達(dá)率在免疫耐受期患者組、低或非復(fù)制期患者組與正常人組均較對(duì)照組升高(P<0.05)，CD86和HLA-DR的表達(dá)率在免疫耐受期、低或非復(fù)制期以及正常人3組間無顯著性差異(P>0.05)，而免疫耐受期患者的CD80表達(dá)率低于其他兩組(P<0.05)；③MLR實(shí)驗(yàn)顯示，HBeAg刺激組的DC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的能力較對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.05)，在DC：T比例為1：5、1：10、1：20時(shí)，免疫耐受期、低或非復(fù)制期以及

8、正常人3組間的刺激指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)；④ELISA檢測HBeAg刺激組和對(duì)照組IL-12p70的水平，發(fā)現(xiàn)HBeAg刺激組DC分泌IL-12p70的水平在免疫耐受期患者組、低或非復(fù)制期患者組與正常人組均較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，3組間細(xì)胞因子水平無顯著性差異(P>0.05)。 4、經(jīng)HBeAg刺激激活的T細(xì)胞可以有效的抑制HBsAg、HBcAg mRNA的表達(dá)，以及HBsAg、HBeAg的合成(P<0.05

9、)，且隨著HBeAg刺激濃度的升高，上述指標(biāo)的表達(dá)量逐漸降低。 結(jié)論： 1、利用GM-CSF和IL-4可以從人外周血中擴(kuò)增出大量DC，為后續(xù)研究做準(zhǔn)備。 2、免疫耐受期患者的DC的成熟和功能存在障礙，低或非復(fù)制期患者DC功能明顯強(qiáng)于前者，DC功能的狀態(tài)可能是發(fā)生血清轉(zhuǎn)換的重要原因。 3、HBeAg體外負(fù)載可以提高DC功能，可能對(duì)增強(qiáng)免疫耐受期患者的HBeAg特異性免疫應(yīng)答有重要作用。 4、HBeA