無(wú)乳鏈球菌表面蛋白鑒定及檢測(cè)方法建立.pdf

1、無(wú)乳鏈球菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎發(fā)生與傳染的主要致病菌之一，對(duì)牛奶的產(chǎn)量、質(zhì)量和生產(chǎn)成本都產(chǎn)生嚴(yán)重的不利影響，因此，建立快速靈敏的無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)方法對(duì)于保障奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展意義重大。
　　本論文對(duì)無(wú)乳鏈球菌表面蛋白進(jìn)行了提取和鑒定，在此基礎(chǔ)上通過(guò)對(duì)免疫分析方法工作條件的優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用的、以表面蛋白為檢測(cè)靶標(biāo)的無(wú)乳鏈球菌雙抗夾心ELISA方法。利用變?nèi)芫貙?duì)無(wú)乳鏈球菌表面蛋白進(jìn)行了提取，并利用雙向電泳、免疫印跡和質(zhì)譜分

2、析，對(duì)無(wú)乳鏈球菌的表面蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，無(wú)乳鏈球菌ATCC BAA-1138(Ia)上存在著豐富的表面蛋白，其中既包括已經(jīng)鑒定的表面蛋白，也包含未鑒定的表面蛋白。成功檢測(cè)到了17種表面蛋白。此外，本研究利用重組技術(shù)大量制備和純化了無(wú)乳鏈球菌的3種表面蛋白，并免疫新西蘭白兔和白拉克母雞制備了多克隆抗體，三種蛋白兔抗的最高效價(jià)分別達(dá)到48000、36000和36000，雞抗的最高效價(jià)分別達(dá)到24000、18000、16000。利用A

3、lpha和Rib表面蛋白多抗作為捕獲抗體、Sip表面蛋白多抗作為檢測(cè)抗體，優(yōu)化并建立了無(wú)乳鏈球菌的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法，通過(guò)優(yōu)化確定了最佳的檢測(cè)條件:捕獲抗體的包被量為0.5μg/孔;選擇0.05M PBS(pH8.0)為包被緩沖液，包被條件為37℃條件下預(yù)包被3h后放4℃過(guò)夜;封閉液為1％明膠，封閉條件為37℃封閉1.0h;檢測(cè)抗體的稀釋倍數(shù)為1∶1000，最佳孵育時(shí)間60分鐘，酶標(biāo)二抗的作用時(shí)間40分鐘。最佳檢測(cè)條件下，所建立

4、檢測(cè)方法的靈敏度為1.98×105 CFU/mL。
　　利用其它導(dǎo)致奶牛乳房炎的細(xì)菌停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）進(jìn)行特異性檢測(cè)，所有菌株在檢測(cè)濃度下的P/N均小于2，表示沒(méi)有顯著的交叉反應(yīng)。
　　與無(wú)乳鏈球菌傳統(tǒng)常規(guī)培養(yǎng)檢測(cè)方