蘋果MdWRKY33基因在輪紋病抗性形成中的作用機制研究.pdf

1、蘋果輪紋病是制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一，由致病真菌Botryosphaeriadothidea引起。該病菌不僅能夠侵染枝干，導致樹體衰弱，還能侵染果實，形成同心輪紋病斑致果實腐爛;同時由于該病菌的潛伏特性，使蘋果輪紋病成為果實貯運期的重要病害之一，致使蘋果產(chǎn)量和品質急劇下降，造成嚴重的經(jīng)濟損失。
　　植物在與病原菌漫長的協(xié)同進化過程中形成了極為復雜的抗病與免疫反應機制，使其能夠針對特定病原菌的入侵而相應地激發(fā)植物抗病反應。

2、經(jīng)典的植物病理學研究表明:植物抗營活體寄生菌主要依賴于水楊酸信號轉導途徑，而抗營腐體寄生菌主要依賴于茉莉酸/乙烯信號轉導途徑。輪紋病菌屬于兼性寄生菌，目前對該病菌與蘋果互作的分子機制研究以及該病菌入侵后引起的抗病反應的研究，報道較少。因此，開展輪紋病菌與蘋果果實互作的分子機制研究，對蘋果抗病基因的挖掘、輪紋病菌防治機理的豐富和抗輪紋病新品種的培育均具有重要意義。
　　本文以易感品種‘富士’果實為試材，首先研究了輪紋病菌B.doth

3、idea在蘋果果實中的擴展方式以及對蘋果果實細胞的傷害;其次研究了乙烯信號分子在蘋果果實發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)了乙烯在蘋果果實與輪紋病菌互作中作為致病因子，促進果實發(fā)病;此外還發(fā)現(xiàn)轉錄因子MdWRKY33參與調控了蘋果病程相關基因MdPRs的表達，并且介導了乙烯的致毒作用。
　　主要研究結果如下:
　　1.運用半薄切片與掃描電鏡技術研究發(fā)現(xiàn)，B.dothidea侵入果實細胞后，菌絲大量存在于植物細胞壁與細胞間隙中。細胞壁降解為受

4、B.dothidea侵染的蘋果果實細胞的典型受害癥狀;部分受害細胞發(fā)生質壁分離;核染色質濃縮并聚集于核膜上，呈典型細胞凋亡癥狀。
　　2.乙烯在輪紋病發(fā)病過程中作為致毒因子促進蘋果果實發(fā)病。對不同成熟度與生理狀態(tài)的三批果實，即‘富士’幼果、新鮮成熟果實與儲藏果實，接種輪紋病菌后，施用乙烯抑制劑1-MCP，能夠顯著抑制果實發(fā)病;1-MCP對病斑的抑制作用呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，1-MCP濃度越高，抑制作用越明顯;相同濃度1-MCP對成

5、熟果實病斑擴展的抑制效果最好;用外源乙烯預處理能夠促進果實病斑擴展。
　　3.在乙烯抑制劑1-MCP處理下，蘋果病程相關基因MdPRs的表達進一步升高。B.dothidea能夠誘導‘富士’幼果和新鮮成熟果中MdPR-5、MdPR-8和MdPR-4基因的表達，當用1-MCP處理接菌果實，病菌侵染誘導的MdPRs基因的表達進一步增強;而在儲藏成熟果實中，輪紋病菌侵染卻抑制了MdPRs基因的表達，1-MCP處理能夠完全逆轉輪紋病菌對Md

6、PRs基因的抑制作用。此外，編碼幾丁質酶的MdChiB-1基因在幼果中不被輪紋病菌誘導，用1-MCP處理之后，其表達在輪紋病菌侵染下顯著升高;新鮮成熟果實在1-MCP處理下，該基因的表達在輪紋病菌侵染下也進一步增強;而在儲藏果實中，輪紋病菌對該基因的抑制作用被去除。因此，在1-MCP處理下，蘋果病程相關基因MdPRs表達水平進一步升高，可能是增強蘋果抗病能力，限制病斑擴展的重要因素。
　　4.蘋果轉錄因子MdWRKY33-1(MD

7、P0000296025)的表達與病程相關基因MdPRs的表達高度協(xié)同。通過對19個轉錄因子做RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，B.dothidea只能誘導幼果中乙烯信號轉錄因子MdERF2的表達并且對幼果中MdERF3、MdERF98-3、MdERF98-6和MdERF98-7的誘導作用比對成熟果顯著，1-MCP處理能抑制B.dothidea對ERFs的誘導表達;只有轉錄因子MdWRKY33-1的表達在接菌果實的乙烯合成和信號轉導途徑被抑制時，表達

8、進一步升高，與MdPRs表達變化高度協(xié)同——在幼果中變化不大，在成熟果中表達量進一步升高，在儲藏果中的表達抑制被解除;在各種激素和過氧化物等非生物脅迫下，‘嘎啦’組培苗中的MdWRKY33-1與MdChiB-1、MdPR-5、MdPR-8、MdPR-4這些MdPRs的表達變化也表現(xiàn)出了高度協(xié)同。
　　5.MdWRKY33-1過表達能提高病程相關蛋白基因MdPRs的表達。轉化蘋果原生質體過表達ERFs和MdWRKY33轉錄因子，發(fā)現(xiàn)

9、只有MdWRKY33-1能明顯提高MdPRs的表達，說明MdWRKY33-1對MdPRs的表達起調控作用。
　　6.在蘋果果實中，輪紋病菌所誘導的乙烯合成途徑與果實成熟過程中的乙烯合成途徑不同。B.dothidea誘導的乙烯合成是通過影響MdACS5a，MdACS5b的表達來實現(xiàn)，與蘋果果實成熟過程中乙烯的合成途徑不同（MdAS1，MdACS3）。通過RT-PCR技術分析發(fā)現(xiàn)，負責介導由傷害脅迫引發(fā)的植物乙烯合成中的MdACS5a

10、和MdACS5b基因的表達，能被輪紋病菌顯著誘導，但輪紋病菌不能誘導負責果實成熟過程中乙烯合成與躍變的MdACS1和MdACS3的表達，說明B.dothidea誘導的果實乙烯合成與蘋果果實成熟過程中的乙烯合成不同。乙烯受體基因MdERS1、MdERS2只在幼果中被B.dothidea誘導，在成熟果實中不被誘導，1-MCP處理能夠抑制B.dothidea對它們的誘導作用;類似地，輪紋病菌對幼果乙烯受體基因MdETR2、乙烯轉錄因子MdER