O-GlcNAc對(duì)p120與E-cadherin相互作用的調(diào)節(jié)及其機(jī)制研究.pdf

1、E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附在大部分上皮細(xì)胞癌中缺失，進(jìn)而誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。p120作為E-cadherin粘附復(fù)合體的重要調(diào)節(jié)子，負(fù)責(zé)維持E-cadherin的穩(wěn)定性和平衡周轉(zhuǎn)。p120的缺失能夠促使E-cadherin細(xì)胞內(nèi)吞而降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞粘附的降低及腫瘤惡性度的增加。因此，研究p120與E-cadherin相互作用的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，p120蛋白的翻譯后修飾參與了E-cadherin粘附復(fù)合體功能

2、的調(diào)節(jié)。如p120的磷酸化修飾參與調(diào)控E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞粘附。
　　O-GlcNAc是一種發(fā)生在蛋白質(zhì)絲氨酸和蘇氨酸殘基上的O連接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linkedβ-N-acetylglucosamine)單糖修飾，O-GlcNAc修飾基團(tuán)添加和移除分別由糖基轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)完成。O-GlcNAc修飾參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、、基因轉(zhuǎn)錄等生命活動(dòng)，影響相關(guān)蛋白的定位、蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白降解等。O-GlcNAc修飾的異常與糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病等多種人類(lèi)疾病相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期證明，O-GlcNAc修飾在多種腫瘤中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，增加細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平可抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞中E-cadherin的膜分布，影響細(xì)胞粘附能力，并發(fā)現(xiàn)4T1細(xì)胞中p120蛋白被O-GlcNAc修飾。基于以上結(jié)果，我們推測(cè)p120的O-GlcNAc修飾可能

4、參與了O-GlcNAc調(diào)節(jié)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附這一過(guò)程。因此，本論文對(duì)p120的O-GlcNAc修飾及OGT蛋白在p120與E-cadherin相互作用過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　為了研究O-GlcNAc修飾對(duì)E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附的調(diào)控是否具有普遍性，本論文利用免疫熒光、免疫共沉淀和免疫印跡等技術(shù)在其它幾種細(xì)胞中檢測(cè)了O-GlcNAc修飾對(duì)p120/E-cadherin復(fù)合體的調(diào)節(jié)

5、作用。結(jié)果表明，O-GlcNAc修飾降低人胚腎細(xì)胞HEK293T、肺癌細(xì)胞A549、前列腺癌細(xì)胞BPH-1中p120和E-cadherin在粘附復(fù)合體中的分布，抑制p120和E-cadherin的結(jié)合。
　　前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞中的p120存在O-GlcNAc修飾，本研究采用多種O-GlcNAc修飾檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)了不同細(xì)胞中(人胚腎細(xì)胞HEK293T、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299和人腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞A549)p12

6、0的O-GlcNAc修飾。結(jié)果表明，以上三種細(xì)胞中，p120均存在O-GlcNAc修飾;并且，通過(guò)OGT沉默或過(guò)表達(dá)OGT改變細(xì)胞總糖鏈，p120的O-GlcNAc修飾水平也隨之發(fā)生變化。
　　上述實(shí)驗(yàn)證明O-GlcNAc對(duì)p120/E-cadherin復(fù)合體形成的調(diào)節(jié)作用以及p120的O-GlcNAc修飾在多種細(xì)胞中普遍存在，我們進(jìn)而研究了p120的O-GlcNAc修飾是否在其與E-cadherin結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)

7、現(xiàn)在HEK293T細(xì)胞中，與E-cadherin粘附復(fù)合體結(jié)合的p120的O-GlcNAc修飾水平明顯低于非結(jié)合的p120。另外，F(xiàn)lag-Pulldown結(jié)果顯示，具有高水平O-GlcNAc修飾的p120與E-cadherin的結(jié)合能力低于具有低修飾水平的p120。這些結(jié)果說(shuō)明p120的O-GlcNAc修飾對(duì)p120與E-cadherin的結(jié)合起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　為研究p120的O-GlcNAc修飾抑制其與E-cadherin結(jié)

8、合的機(jī)制，p120被分割成四個(gè)截短突變體（N端區(qū)、磷酸化調(diào)節(jié)區(qū)、Armadillo結(jié)構(gòu)域和C端區(qū)），并檢測(cè)各突變體的O-GlcNAc修飾水平，確定O-GlcNAc修飾的主要區(qū)域?yàn)锳rmadillo結(jié)構(gòu)域。利用上述相同方法證明Armadillo結(jié)構(gòu)域上的O-GlcNAc修飾抑制其與E-cadherin的結(jié)合。這些結(jié)果表明，O-GlcNAc可能通過(guò)對(duì)p120Armadillo區(qū)的修飾，抑制p120與E-cadherin的相互作用。
　

9、　由于p120具有O-GlcNAc修飾，因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了OGT與p120的相互作用。免疫共沉淀和Pulldown實(shí)驗(yàn)表明，OGT蛋白可與p120蛋白通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)區(qū)或Armadillo結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合;但OGT不能與E-cadherin結(jié)合，并且OGT不能結(jié)合到p120/E-cadherin復(fù)合體上。由于Armadillo結(jié)構(gòu)域也是E-cadherin結(jié)合區(qū)，因此我們推測(cè)是否OGT與p120的結(jié)合可抑制p120與E-cadherin的

10、結(jié)合。體外蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明，OGT濃度依賴(lài)性地抑制p120與E-cadherin的相互作用;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明OGT不依賴(lài)其催化活性也可抑制E-cadherin粘附復(fù)合體的形成，該作用可能通過(guò)其與p120的結(jié)合實(shí)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為p120與E-cadherin的相互作用以及E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞粘附提供了新的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　綜上所述，本文首次證明在不同細(xì)胞系中p120的O-GlcNAc修飾具有普遍性，并且p120的O-GlcNAc修