四種中藥多糖增強(qiáng)免疫和抗病毒作用及機(jī)理研究.pdf

1、在動(dòng)物生產(chǎn)中，通過(guò)應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑提高免疫功能，從而增強(qiáng)對(duì)病毒性傳染病的抵抗力具有重要意義。然而目前常用的免疫增強(qiáng)劑大多是化學(xué)合成類，存在藥物殘留隱患。隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注，天然藥物顯示出一定優(yōu)勢(shì)。研究表明，許多中藥成分有免疫增強(qiáng)作用。多糖為一類重要的中藥成分，不僅有抗病毒的作用，而且能增加機(jī)體的免疫能力，作為免疫增強(qiáng)劑具有安全低毒、不易在畜產(chǎn)品中產(chǎn)生有害殘留等優(yōu)點(diǎn)。本研究選擇4種中藥多糖為研究對(duì)象，從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面研究了它們的增

2、強(qiáng)免疫和抗病毒的作用和機(jī)理，旨在為開(kāi)發(fā)多糖類免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。 試驗(yàn)Ⅰ、四種中藥多糖的制備 為了給整個(gè)研究準(zhǔn)備材料，選擇文獻(xiàn)報(bào)道具有較好免疫增強(qiáng)作用的黃芪多糖(APS)、板藍(lán)根多糖(IRPS)、山藥多糖(CYPS)、牛膝多糖(ARPS)4種中藥多糖作為研究對(duì)象。采用水煎醇沉法提取，用硫酸蒽酮法測(cè)定多糖的含量。結(jié)果，APS、IRPS、CYPS、ARPS的提取率(g/Kg)分別為37.4、59.1、53.6、48.9，

3、糖含量(％)分別為65.8、56.7、73.5、54.9。 試驗(yàn)Ⅱ、四種多糖對(duì)新城疫病毒感染細(xì)胞能力的影響 為了評(píng)價(jià)4種多糖的抗病毒作用和機(jī)理，將黃芪多糖(APS)、板藍(lán)根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山藥多糖(CYPS)與新城疫病毒以3種順序加入培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞單層上，即先加多糖、先接種病毒、病毒和多糖感作后同時(shí)加入，觀察細(xì)胞病變程度，并用MTT法測(cè)定細(xì)胞OD值的變化，以評(píng)價(jià)它們對(duì)新城疫病毒感染細(xì)胞能力的

4、影響。結(jié)果顯示，APS和IRPS的效果較好，而且先加多糖后接種病毒可以減輕病毒造成的細(xì)胞病變，且有一定的量效關(guān)系。表明，多糖的臨床應(yīng)用以早給藥的效果為好。 試驗(yàn)Ⅲ、四種多糖對(duì)雞脾臟淋巴細(xì)胞增殖及一氧化氮的影響 為了研究4種中藥多糖增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用和機(jī)理，將5種濃度的黃芪多糖(APS)、板藍(lán)根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山藥多糖(CYPS)分別加入到培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞中，培養(yǎng)24h時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，測(cè)定

5、一氧化氮含量和一氧化氮合酶的活力；培養(yǎng)48h時(shí)用MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果表明，適宜濃度的4種多糖均能提高細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量、一氧化氮合酶的活力和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，且效果相當(dāng)。這可能是多糖提高細(xì)胞免疫功能的機(jī)理之一。 試驗(yàn)Ⅳ、四種多糖對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞IL-4和IFN-γ的mRNA表達(dá)的影響 為了研究4種中藥多糖增強(qiáng)免疫的作用和分子機(jī)理，用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)白介素-4(inter

6、leukin-4，IL-4)引物，一對(duì)干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)引物。用熒光定量PCR方法測(cè)定4種多糖對(duì)雞外周血T淋巴細(xì)胞IL-4、IFN-γ的mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，合適劑量的APS、IRPS、ARPS和CYPS均能提高淋巴細(xì)胞IL-4、IFN-γ的mRNA表達(dá)水平，APS、IRPS的效果優(yōu)于ARPS、CYPS。這可能是多糖增強(qiáng)免疫的分子機(jī)制之一。 試驗(yàn)Ⅴ、四種多糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能、溶血素及

7、溶血空斑形成的影響及劑量篩選 為了觀察4種多糖對(duì)非特異性免疫功能的影響并篩選出合適的劑量，選取102只小鼠隨機(jī)分為17組，16個(gè)試驗(yàn)組的小鼠分別腹腔注射4種濃度的黃芪多糖(APS)、板藍(lán)根多糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山藥多糖(CYPS)溶液，對(duì)照組注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)3天。第8天分別測(cè)定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、溶血素及溶血空斑的變化。結(jié)果顯示，4種多糖均能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高溶血空斑及溶血素水平；APS

8、在30 mg·kg<'-1>、IRPs在20 mg·kg<'-1>、ARPS和CYPS在50 mg·kg<'-1>時(shí)的效果較好。 試驗(yàn)Ⅵ、四種多糖對(duì)免疫雛雞抗體效價(jià)及免疫器官指數(shù)的影響 為了研究4種多糖增強(qiáng)特異性體液免疫和非特異性免疫的作用和機(jī)理，選取450羽羅曼公雞隨機(jī)均分成9組，14日齡用新支二聯(lián)弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻首免、28日齡肌肉注射二免，在首次免疫的同時(shí)，8個(gè)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、低劑量的黃芪多糖(APS)、板藍(lán)根多

9、糖(IRPS)、牛膝多糖(ARPS)和山藥多糖(CYPS)溶液，對(duì)照組注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射3次。分別于首次免疫后第7、14、21、28、35、42、49和56天，用微量法測(cè)定新城疫HI抗體效價(jià)；于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，稱取體重、脾臟、胸腺和法氏囊的重量，計(jì)算免疫器官指數(shù)。結(jié)果，低劑量的APS、IRPS和高劑量的ARPS、CYPS均能顯著提高ND HI抗體效價(jià)和免疫器官指數(shù)，且低劑量的APS、IRP

10、S效果較好。表明4種多糖既可以協(xié)同疫苗增強(qiáng)特異性免疫，也能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育以提高非特異性免疫。 試驗(yàn)Ⅶ、四種多糖對(duì)免疫雛雞T淋巴細(xì)胞增殖及其CD4<'+>、CD8<'+>亞群的影響 為了研究4種多糖體內(nèi)增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用和機(jī)理，選取450羽羅曼公雞隨機(jī)均分成9組，14日齡用新支二聯(lián)弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻首免、28日齡肌肉注射二免，在首次免疫的同時(shí)，8個(gè)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、低劑量的黃芪多糖、板藍(lán)根多糖、牛膝多糖和山藥多糖溶液，

11、對(duì)照組注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60天，分別用MTT法和流式細(xì)胞儀雙染色法測(cè)定外周血T淋巴細(xì)胞增殖和CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>和CD3<'+>CD8<'+>T淋巴細(xì)胞含量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，4種多糖均能顯著促進(jìn)外周血中T淋巴細(xì)胞增殖，提高CD3<'+>、CD3<'+>CD4<'+>T淋巴細(xì)胞含量和CD4<'+>/CD8<'+>的比值，低劑量的APS和IRPS的效

12、果最好。這可能是4種多糖增強(qiáng)細(xì)胞免疫的機(jī)理之一。 試驗(yàn)Ⅷ、四種多糖對(duì)免疫雛雞黏膜免疫功能的影響 為了研究4種多糖增強(qiáng)黏膜免疫的作用和機(jī)理，選取450羽羅曼公雞隨機(jī)均分成9組，14日齡用新支二聯(lián)弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻首免、28日齡肌肉注射二免，在首次免疫的同時(shí)，8個(gè)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、低劑量的黃芪多糖、板藍(lán)根多糖、牛膝多糖和山藥多糖溶液，對(duì)照組注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射3次。于首次免疫后第10、20、30、40、50和60