水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因OsHAK5的功能研究.pdf

1、鉀(K)是植物生長發(fā)育必需的大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，廣泛參與植物的各種生理和生化過程，如植物的細胞膨壓和滲透壓調(diào)節(jié)、氣孔開閉、離子平衡、酶的活化、抵御生物和非生物脅迫等。由于鉀在土壤中容易被固定淋失、農(nóng)作物秸稈的收獲帶走一部分鉀和長期大量的使用氮、磷肥而鉀肥施用量不足，造成我國土壤中普遍缺鉀，嚴重限制農(nóng)業(yè)發(fā)展。植物吸收鉀離子存在高、低親和兩種吸收機制。在高鉀環(huán)境下，鉀離子通道(K Channels)起主要作用，而低鉀環(huán)境下，鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白

2、(K Transporters:KT)則發(fā)揮主要作用。植物在應(yīng)對低鉀脅迫時，已經(jīng)進化出包括細胞膜的超極化反應(yīng)、根系構(gòu)型變化、增強鉀在不同組織中的流動、細胞外酸化和誘導高親和轉(zhuǎn)運蛋白KUP/HAK/KT(K UptakePermease/High Affinity K transporter/K Transporters)的表達等形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和生理生化上的響應(yīng)機制以提高對鉀的吸收和再利用。已有研究結(jié)果表明，KUP/HAK/KT是組成水稻中

3、最大的鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白家族，預(yù)測水稻HAK家族有27個成員，在我們的研究開始之際，國際上還沒有關(guān)于該家族成員在水稻中的表達特征和生理功能的報道。因此，開展對水稻高親和鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白生理功能研究，對于揭示水稻在低鉀脅迫下的吸收和轉(zhuǎn)運鉀素營養(yǎng)的生理、分子機制和培育鉀高效利用水稻新品種具有重大意義。
　　本研究以模式作物水稻為研究對象，深入研究水稻高親和鉀轉(zhuǎn)運蛋白基因OsHAK5的生理功能，我們對該基因表達模式的研究、組織和亞細胞定位、異

4、源系統(tǒng)的功能鑒定，以及該基因超表達和敲除材料獲得與表型分析等一系列具體的分子和生理試驗，獲得主要研究結(jié)果如下:
　　1、OsHAK5基因的表達模式研究表明，該基因受缺鉀誘導上調(diào)。啟動子融合GUS報告基因結(jié)果表明，OsHAK5在根表皮、側(cè)根原基、側(cè)根、中柱細胞、根莖結(jié)合部、葉片、花藥、胚、種子和種殼都有表達，且在根、根莖結(jié)合處和葉片受缺鉀誘導，表達增強。亞細胞定位結(jié)果顯示OsHAK5是一個定位于細胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白。啟動子分割試驗結(jié)

5、果表明:OsHAK5基因轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游-1479到-1776bp范圍內(nèi)可能存在受缺鉀誘導的順式作用元件(cis-element)。OsHAK5表達受不同植物激素的誘導（上調(diào)或下調(diào)），且在ATG上游-1479到-1776bp范圍內(nèi)有響應(yīng)生長素信號的順式作用元件ASF1MOTIFCAMV，外源添加IAA處理，顯著增強OsHAK5啟動子融合的GUS基因在不同組織的表達活性。
　　2、通過構(gòu)建酵母表達載體pYES2-OsHAK5，

6、以空載體pYES2作對照，將其分別轉(zhuǎn)入鉀離子吸收缺陷型酵母突變菌株R5421和鹽敏感型酵母突變菌株AXT3中，以驗證OsHAK5在酵母異源體系中的功能，酵母打點試驗結(jié)果表明:在高鉀濃度(20 mM K+;50 mM K+)的固體培養(yǎng)上，OsHAK5轉(zhuǎn)化子和空載體生長無明顯差異，而在低鉀(0.05 mM K+到1 mM K+)培養(yǎng)基上，OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母的生長能力顯著優(yōu)于空載體酵母。在高鹽濃度的培養(yǎng)基上，OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母比空載體

7、酵母具有更強的耐鹽能力，通過對液體培養(yǎng)的酵母進行高鹽處理然后進行鉀、鈉離子含量測定結(jié)果表明:OsHAK5轉(zhuǎn)化子酵母比空載體酵母在高鹽處理下積累更多的K+而不提高Na+吸收，因此，OsHAK5在酵母中表現(xiàn)為高親和鉀選擇性轉(zhuǎn)運體。
　　3、一定時間的低K(0.3 mM K+)和不加K(0 mM K+)水培試驗研究表明:OsHAK5超表達材料的生物量、地上部K濃度、K吸收總量和單位時間的K凈吸收速率均顯著高于野生型材料，有趣的是，根中K

8、濃度反而顯著低于野生型材料。OsHAK5突變體材料的生物量、K吸收總量和單位時間鉀離子凈吸收速率顯著降低，而根部的K濃度顯著高于野生型材料。正常供鉀時，超表達和野生材料生長沒有差異，而突變體材料生長受阻的表型不能通過高鉀恢復(fù)。為了進一步證明OsHAK5參與水稻根系在低K環(huán)境中吸收K的生理功能，利用NMT（非損傷原位測定技術(shù)）測定了OsHAK5超表達、沉默和野生型水稻根尖鉀離子吸收流速。在正常供K(1 mMK+)時，OsHAK5超表達和沉

9、默材料及其對應(yīng)的野生型水稻材料根系鉀離子吸收流速無明顯差異，而低K(0.1 mM K+)處理時，超表達材料鉀離子吸收流速較野生型顯著提高，而突變體材料顯著降低。此外，傷流液試驗結(jié)果表明，在低K和完全缺K處理時，超表達材料傷流液中的K濃度和K外流速率顯著高于野生型，而突變體材料則呈相反趨勢。我們的研究結(jié)果表明在低鉀條件下，OsHAK5不僅有助于水稻對K的吸收，還能增強其地下向地上的轉(zhuǎn)運。
　　4、OsHAK5基因在鹽脅迫中的生理功能

10、研究結(jié)果表明，在鹽脅迫(100mMNaCl)處理下，超表達材料的生物量、K吸收總量和地上部的K+/Na+均顯著高于野生型，抗鹽脅迫能力增強。與野生型相比，突變體植株地上部的Na+濃度和Na+/K+顯著增高，而生物量和K吸收總量顯著降低，抗鹽能力減弱。這一結(jié)果也驗證了我們對酵母試驗的結(jié)論。
　　5、對OsHAK5超表達和敲除水稻植株的表型分析發(fā)現(xiàn)，OsHAK5影響了水稻株型具體表現(xiàn)為:與野生型材料相比，超表達材料總分蘗和有效分蘗較野

11、生型顯著增加，而突變體材料總分蘗和有效分蘗顯著減少，超表達和突變體材料的株高都顯著降低。超表達、突變體和野生型材料根尖和根莖結(jié)合部生長素含量測定結(jié)果表明，OsHAK5超表達和沉默材料的根尖生長素含量只有對應(yīng)野生型材料的50％，超表達材料根莖結(jié)合部生長素含量顯著高于野生型，而沉默材料呈相反趨勢。OsHAK5的超表達和沉默影響了水稻植株生長素輸出載體蛋白PIN家族成員相關(guān)基因和輸入蛋白AUX1的表達，同時也影響了分蘗數(shù)（OsFC1）和分蘗角

12、度(OsLazy1; OsTAC)相關(guān)基因的表達且超表達材料和沉默材料的表達變化呈現(xiàn)相反的趨勢。此外，OsHAK5還影響了[3H]-IAA在水稻植株中的極性運輸。不同pH值處理下的根系生長試驗結(jié)果表明，在pH值為4.5的處理下，超表達根系生長顯著優(yōu)于野生型，而當pH值為5.5和6.5處理下，超表達和野生型根系無明顯差異，而沉默材料根系在pH值為4.5、5.5和6.5均表現(xiàn)根系生長受阻現(xiàn)象，尤其在pH4.5處理下根系生長受阻更加嚴重。推測