鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)基因OsHAKα和OsKβ與水稻耐鹽性的關(guān)系研究.pdf

1、K+是高等植物中重要的營養(yǎng)元素，也是非鹽生植物中最豐富的無機陽離子，在植物許多細胞過程中發(fā)揮著重要作用，參與植物細胞的滲透調(diào)節(jié)。植物鉀離子轉(zhuǎn)運體介導植物從土壤中積累和在不同植物組織內(nèi)的K+分布，根據(jù)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，可分為五個家族:Shaker通道、KCO通道、KUP/HAK/KT轉(zhuǎn)運體、TrK/HKT轉(zhuǎn)運體和K/H逆向轉(zhuǎn)運體。本文研究水稻HAK轉(zhuǎn)運體OsHAKα和Shaker家族的OsKβ及其在水稻耐鹽中的作用。
　　利用OsHAK

2、α和OsKβ各自的突變體與相應野生型在鹽脅迫時的表型，鉀鈉離子含量，死亡率，干鮮重等生理指標，研究OsHAKα和OsKβ在水稻響應鹽脅迫時的作用。實驗發(fā)現(xiàn)OsHAKα的突變體在200mmol/LNaCl濃度下，種子的發(fā)芽時間延遲、發(fā)芽率降低70％，OsKβ的突變體在一定鹽濃度范圍內(nèi)(0-250mmol/L)，種子發(fā)芽率沒有明顯變化。鹽濃度在0-300mmol/L時，兩基因突變體突變體的根長受低濃度鹽溶液刺激，有一定的增長，高濃度鹽處理時

3、根長生長受抑制，在250mmol/LNaCl濃度下根長長度是對照WT苗的50％左右，兩基因突變體的苗高都受到NaCl溶液的抑制，在250mmol/LNaCl濃度苗高為對照苗的50％左右。120mmol/LNaCl濃度處理水稻苗8d，兩基因的突變體死亡率比相應野生型死亡率高1.25倍左右，干重降低60％左右，鮮重降低75％左右。120mmol/LNaCl處理的0d至8d里，OsHAKα的突變體的Na+含量隨著天數(shù)的增加是升高的，K+含量隨

4、天數(shù)的增加是降低的，在第8d，Na+含量是相應野生型的1.3倍，K+含量是相應野生型的75％。OsKβ的突變體的NA+和K+含量隨著天數(shù)的變化不明顯，但該突變體表現(xiàn)出比相應野生型高死亡率的明顯表型。這些結(jié)果表明OsHAKα和OsKβ兩個基因可能正向調(diào)節(jié)水稻抗鹽害能力。研究結(jié)果為進一步研究基因功能以及作用機制提供了基礎(chǔ)。
　　為了進一步驗證這兩個基因在耐鹽中的作用，我們用RNA干擾的方法。首先，選取從OsHAKα3’端開始加不同長度

5、CDS的兩段不同長度的特異性片段，從OsKβ3’端開始加一定長度CDS的基因片段，從OsKβ中間跨膜功能性區(qū)域選取特異性片段，共四段特異性片段。先利用水稻原生質(zhì)體為材料，快速研究基因功能的雙鏈RNA瞬時干擾體系，在最優(yōu)化的瞬時干擾系統(tǒng)條件下，將四個特異性片段連接T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄合成的dsRNA轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，半定量RT-PCR結(jié)果顯示，兩個基因可以在水稻原生質(zhì)體體內(nèi)瞬時被干擾沉默，OsHAKα的干擾率可以達到65％，OsKβ的干擾

6、率可以達到60％。四個片段轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體可明顯降低基因的表達水平。
　　其次，經(jīng)過瞬時干擾確定所選片段分別被插入表達載體pSuper1300所加入的PDK功能性內(nèi)含子的兩端，構(gòu)建成了含有內(nèi)含子發(fā)卡結(jié)構(gòu)的ihpRNA表達載體，通過農(nóng)桿菌介導，用轉(zhuǎn)染水稻愈傷組織進行驗證，經(jīng)過抗性篩選和PCR檢測，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株;半定量RT-PCR結(jié)果顯示所獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株中，OsHAKα和OsKβ兩個基因表達量下降，表明該干擾載體能夠分別有效抑