IRF-2在胰腺癌中的功能及其對胰腺癌細胞化療敏感性的影響.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤。雖然近年來診斷和治療技術不斷提高，但胰腺癌病人生存狀況仍不容樂觀，這與胰腺癌發(fā)病機制復雜，多種基因參與調控，缺少有效的治療靶點等有關。干擾素調控因子2(IRF-2)是干擾素調控因子家族的一員，其功能涉及免疫調節(jié)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有的研究表明，干擾素調控因子2參與了乳腺癌、黑色素瘤、食管癌等多種腫瘤的形成，但是其在胰腺癌中還未見系統(tǒng)性的功能研究。
　　 在本課題中，我們研究了IRF-2基因在胰腺癌

2、中的功能，著重進行了以下四個部分的工作：(1)構建IRF-2基因RNA干擾的載體，并在胰腺癌細胞系中穩(wěn)定沉默IRF-2的表達；(2)研究IRF-2對胰腺癌細胞系生長、增殖、侵襲、轉移等生物學特性的影響，并進一步闡述其機制；(3)探討胰腺癌細胞IRF-2沉默以后對吉西他濱化療敏感性的影響；(4)結合臨床數(shù)據(jù)，探討IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達情況，并分析IRF-2的表達與病人臨床病理指標及預后的關系。
　　 第一部分：IRF-

3、2基因siRNA載體的構建
　　 目的：構建IRF-2基因的siRNA載體，并檢測其效果。
　　 方法：首先設計針對IRF-2 mRNA不同位點的特異性siRNA序列，合成寡核苷酸，然后將其連接到pBS/hU6-1載體上；選擇合適的酶切位點與慢病毒載體FG12相連，瓊脂糖電泳及測序鑒定。然后進行大腸桿菌轉化，質粒大量抽提。獲得的質粒，轉染293T細胞進行病毒包裝。最后用病毒感染胰腺癌細胞，檢測干擾效果。
　　 結

4、果：本實驗成功構建連有IRF-2特異性siRNA序列的pBS/hU6-1載體；并成功將序列轉移到FG12慢病毒載體上。在包裝病毒及感染胰腺癌細胞系后，用Western blot檢測，實驗結果表明效果較好，成功構建了下調IRF-2表達的MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌細胞株。
　　 結論：成功構建IRF-2 siRNA載體，獲得下調IRF-2表達的穩(wěn)定胰腺癌細胞株。
　　 第二部分沉默IRF-2對胰腺癌細胞生物學特性

5、的影響
　　 目的：研究沉默IRF-2表達對胰腺癌細胞生長、增殖、侵襲、轉移等的影響。
　　 方法：在得到穩(wěn)定干擾IRF-2表達的胰腺癌細胞株后，通過MTT、BrdU摻入實驗、結晶紫實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、裸鼠體內成瘤實驗、細胞遷移實驗、裸鼠體內轉移實驗等檢驗胰腺癌細胞系生長、增殖、侵襲、轉移等生物學特點的變化，并且進一步從細胞周期改變及細胞凋亡方面闡述其機制。
　　 結果：MTT實驗、BrdU摻入實驗、結晶紫

6、實驗結果證實沉默IRF-2的表達抑制細胞的生長、增殖能力(P<0.05)。軟瓊脂克隆形成實驗、裸鼠體內成瘤實驗表明下調IRF-2的表達以后胰腺癌細胞株的成瘤能力明顯下降。流式細胞實驗表明下調IRF-2的表達后胰腺癌細胞株的凋亡比例明顯上升(P<0.05)，細胞G0-G1期阻滯增加，S期細胞比例明顯下降(P<0.05)。進一步實驗表明下調IRF-2的表達后，與生長、增殖相關的基因：PCNA、CyclinD1明顯下調；與凋亡相關的PARP、

7、BAX、Caspase-8基因明顯上調。細胞遷移實驗、裸鼠體內轉移實驗發(fā)現(xiàn)下調IRF-2的表達對胰腺癌細胞系侵襲、轉移沒有明顯影響。
　　 結論：下調IRF-2表達對于MIAPaCa-2和PANC-1胰腺癌細胞株的生長、增殖和成瘤能力有著明顯的抑制作用，而這種作用是通過改變細胞周期和細胞凋亡來實現(xiàn)；但是下調IRF-2表達對于細胞侵襲、轉移能力沒有明顯的影響。
　　 第三部分沉默IRF-2對胰腺癌細胞化療敏感性的影響

8、>　　 目的：探討沉默IRF-2以后對胰腺癌細胞吉西他濱化療敏感性的影響。
　　 方法：MTT檢測吉西他濱對胰腺癌細胞株PANC-1和MIAPaCa-2的半數(shù)有效劑量(IC50)，了解這兩種細胞對吉西他濱的化療敏感程度，選取相對耐藥的細胞進一步探討沉默IRF-2表達對細胞吉西他濱的化療敏感性的影響。MTT檢測干擾IRF-2基因后細胞對吉西他濱敏感性的變化。結晶紫實驗和裸鼠移植瘤模型檢測干擾IRF-2后是否增強吉西他濱對體外細胞

9、克隆形成及體內成瘤能力的抑制作用。流式細胞技術檢測沉默IRF-2基因前后細胞周期和細胞凋亡情況，Western blot檢測與細胞增殖和凋亡相關基因的表達情況，并探討可能的機制。
　　 結果：PANC-1和MIAPaCa-2細胞中均表達IRF-2基因，在PANC-1細胞中高于MIAPaCa-2細胞。不同濃度藥物作用72小時，吉西他濱對PANC-1細胞的半數(shù)有效劑量為16.5±2.1μg/ml，而MIAPaCa-2細胞為5.6±1

10、.2μg/ml(P<0.05)。接著，我們利用構建的PANC-1對照細胞和PANC-1干擾IRF-2表達的細胞，不同濃度藥物作用72小時，吉西他濱對PANC-1對照細胞的IC50值為16.3±1.5μg/ml，干擾IRF-2表達的細胞IC50值為9.5±1.4μg/ml(P<0.05)，說明下調IRF-2基因表達后，PANC-1細胞對吉西他濱的敏感性顯著增加。在結晶紫實驗中，與對照細胞+PBS組相比，對照細胞+吉西他濱組及干擾IRF-2

11、表達的細胞+PBS組克隆形成能力下降(P<0.05)，而干擾IRF-2表達的細胞+吉西他濱組克隆形成能力明顯下降(P<0.01)。裸鼠體內成瘤實驗進一步說明了下調IRF-2表達后，PANC-1細胞對吉西他濱的敏感性明顯增強。同樣，流式細胞技術表明，同其他三組相比，干擾IRF-2表達的細胞+吉西他濱組G1期細胞比例增加(P<0.05)，S期細胞比例降低(P<0.05)，細胞凋亡比例增高(P<0.01)；與其他三組細胞相比，干擾IRF-2表

12、達的細胞+吉西他濱組Cyclin D1和PCNA表達水平下降，而與細胞凋亡相關的基因如切割的PARP、BAX和caspase-8增加。
　　 結論：慢病毒介導的RNA干擾技術特異性沉默IRF-2表達，增強胰腺癌細胞PANC-1對吉西他濱的化療敏感性。
　　 第四部分 IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達及與臨床病理指標和預后的關系
　　 目的：研究IRF-2在胰腺癌臨床樣本中的表達情況，并分析IRF-2的表達與臨床

13、病理指標及預后的關系。
　　 方法：選取30例胰腺癌病人臨床新鮮樣本，利用免疫組織化學染色、蛋白免疫印跡、實時定量PCR檢測IRF-2的表達情況；選取156例胰腺癌病人臨床石蠟樣本制作組織芯片，利用免疫組織化學染色進行評分；分析IRF-2的表達與病人臨床病理參數(shù)及預后的關系，探討IRF-2對病人臨床特征及預后的影響。
　　 結果：與正常對照胰腺組織相比，實時定量PCR檢測結果表明在胰腺癌中IRF-2高表達比例為66.7％

14、；免疫組化和Western blot表明IRF-2在癌組織中高表達。組織芯片結果表明IRF-2的表達明顯上調(P<0.01)，在癌組織中高表達比例為77.6％；統(tǒng)計分析表明IRF-2的表達與病人的TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤T分期有關：TNM分期(X2=21.297；P<0.001)；腫瘤分化程度(X2=10.197；P=0.006)；腫瘤T分期(X2=14.512；P=0.001)；U檢驗結果進一步確定這一結論。Kaplan-Mei