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文檔簡(jiǎn)介
1、本課題組從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的EST序列中,識(shí)別出了編碼cathepsin L樣蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列。本論文以該基因及其編碼蛋白為研究對(duì)象,主要研究其生物學(xué)特性,依此評(píng)價(jià)它在免疫診斷和疫苗研究方面的應(yīng)用前景,給肝吸蟲(chóng)病的診斷和防治提供更多的新思路和方法。 目的和意義: 基于蠕蟲(chóng)在寄生蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫逃避、毒力、組織細(xì)胞入侵、脫包囊/包囊形成中發(fā)揮的關(guān)鍵性作用,是免疫診斷、疫苗研制和藥物篩選的理想分子;而目前
2、對(duì)cathepsin L在肝吸蟲(chóng)與宿主相互關(guān)系中的作用缺乏全面認(rèn)識(shí),因此從本課題組已構(gòu)建的華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中,尋找華支睪吸蟲(chóng)的cathepsin L,識(shí)別出該酶基因的全長(zhǎng)cDNA編碼序列。對(duì)原核表達(dá)的重組CsCatL蛋白進(jìn)行基本生物學(xué)特性研究,依此評(píng)價(jià)它在免疫診斷和疫苗研究方面的應(yīng)用前景,給肝吸蟲(chóng)病的診斷和防治提供更多的新思路和方法。 方法: 1.CsCatL基因的生物信息學(xué)分析 通過(guò)BLASTx方
3、法搜索GenBank中其他物種的同源序列,并進(jìn)行多序列同源性比對(duì),分析該蛋白的分子進(jìn)化規(guī)律;并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)CsCatL的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、抗原表位、功能域、以及蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)等基本結(jié)構(gòu)和功能特征進(jìn)行全面的分析和預(yù)測(cè),用于指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究。 2.CsCatL基因的克隆表達(dá)和重組蛋白的純化和復(fù)性 針對(duì)所預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)特征,應(yīng)用分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建CsCatL的前體蛋白、前體肽和成熟肽三個(gè)片段的pET—28a原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿
4、菌中以包涵體形式表達(dá)。用6M尿素溶解包涵體,在變性條件下使用6his—binding親和層析純化重組蛋白,獲得的變性純化蛋白采用透析方法通過(guò)逐步降低尿素濃度進(jìn)行復(fù)性,在尿素濃度為1M時(shí)改用PBS透析,以去除尿素。 3.CsCatL重組蛋白的酶學(xué)特性和功能研究 以特異熒光合成肽Z—Phe—Arg—MCA和Z—Arg—Arg—MCA為底物,測(cè)定rCsCatL—mature的肽水解活性。通過(guò)熒光酶標(biāo)儀測(cè)定,激發(fā)光360nm,測(cè)
5、定465nm熒光波長(zhǎng)的吸光度,依據(jù)AMC標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,換算為產(chǎn)物濃度。計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并通過(guò)酶抑制劑進(jìn)一步研究其酶學(xué)特性。通過(guò)對(duì)牛血清白蛋白、人IgG和血紅蛋白水解作用來(lái)分析其生物學(xué)功能。 4.CsCatL為華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分泌/排泄物的鑒定及在成蟲(chóng)、囊蚴和尾蚴的組織定位 將純化的rCsCatL—promature免疫大鼠制備特異性抗體,對(duì)成蟲(chóng)分泌/排泄物進(jìn)行Western blot分析。 RT—PCR
6、檢測(cè)CsCatL基因在囊蚴和尾蚴表達(dá)情況。 熒光免疫組化方法觀察CsCatL在肝吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、囊蚴和尾蚴階段的組織定位,成蟲(chóng)和囊蚴制作成石蠟切片,尾蚴采用活體。一抗為anti—rCsCatL—promature的rat血清,陰性血清采用rat免疫前陰性血清。熒光顯微鏡下觀察拍照。 5.CsCatL用于免疫學(xué)診斷效果的評(píng)價(jià) 分別以rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—prop
7、etid作為抗原,通過(guò)ELISA方法檢測(cè)華支睪吸蟲(chóng)病人血清中特異IgG、IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA,并與日本血吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)和鉤蟲(chóng)感染的人血清進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試,分析和評(píng)價(jià)三個(gè)重組蛋白的檢測(cè)效果。 6.CsCatL免疫保護(hù)作用 rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠,在免疫組大鼠血清中特異性IgG抗體效價(jià)高于1:102,
8、400時(shí),進(jìn)行肝吸蟲(chóng)囊蚴感染。感染后第20天,每天收集糞便查蟲(chóng)卵,確定最早排蟲(chóng)卵時(shí)間;查到蟲(chóng)卵后,間隔1周,連續(xù)3次,收集糞便,按照司徒爾氏法進(jìn)行蟲(chóng)卵計(jì)數(shù);感染后第70天殺鼠,收集成蟲(chóng)計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.CsCatL基因的生物信息學(xué)分析 CsCatL基因全長(zhǎng)1458bp,編碼區(qū)為80-1191,編碼371aa,在5’端和3’端都有非翻譯區(qū),是全長(zhǎng)編碼序列,Ge
9、nBank中的登錄號(hào)為DQ902583。編碼371aa,aa1-18為分泌型信號(hào)肽,aa109-127為前體肽,aa128-371為成熟肽,屬胞外分泌型蛋白。在前體肽具有cathepsin L的保守結(jié)構(gòu)域ERFNIN、GNFD;成熟肽具有構(gòu)成木瓜蛋白酶活性中心的3個(gè)保守催化位點(diǎn)Asn338、Cys177、His318;N端aa67-127位是保守木瓜蛋白酶前體肽抑制功能域;C端aa57-370屬于木瓜蛋白酶家族;C端aa153-370
10、Peptidase C1功能域?qū)倌竟系鞍酌讣易逯械腖類;與日本血吸蟲(chóng)Cathepsin L1的氨基酸序列的一致可能性達(dá)53%,相似可能性達(dá)69%;預(yù)測(cè)屬Cathepsin L樣蛋白。前體蛋白的理論分子量是40.87kDa,pI是5.14。B細(xì)胞線性表位主要位于前體肽段內(nèi),并且序列的保守性明顯低于酶活性區(qū)域,提示該功能域具有比成熟肽抗原更好的敏感性和特異性。在物種進(jìn)化關(guān)系上,與日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)和衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)源于同一祖先,與
11、日本血吸蟲(chóng)親緣關(guān)系最近。 2.CsCatL基因的克隆表達(dá)和重組蛋白的純化和復(fù)性 成功構(gòu)建原核pET—28a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒,重組質(zhì)粒在原核E.coli BL21以包涵體形式表達(dá),經(jīng)變性純化和復(fù)性后獲得到較純可溶性重組蛋白,rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptid濃度分別為780μg/ml、890μg/ml.200μg/ml。 3.CsCatL重組蛋白的
12、酶學(xué)特性和功能研究 rCsCatL—mature在二硫蘇糖醇存在時(shí)有水解活性,優(yōu)先水解Z—Phe—Arg—AMC而不是Z—Arg—Arg—AMC,其活性100%被特異性半胱氨酸蛋白酶抑制因子E—64和硫醇封閉試劑IAA抑制,胰蛋白酶類抑制劑TPCK和絲氨酸蛋白酶類抑制劑PMSF分別抑制77%和13%酶活性,金屬離子螫合劑EDTA沒(méi)有抑制作用,顯示CsCatL屬于典型Cathepsin L類的半胱氨酸蛋白酶。 rCsC
13、atL—mature在pH4.5-6.0酶活性較高,在pH5.5酶活性最高;28-42℃酶活性差別不是太大,42℃酶活性最高的;假設(shè)所有rCsCatL—maturer都具有酶活性,Km值是5.71×10-6 M,Vmax=0.6μM/min;一個(gè)酶活單位是2.95μg。 rCsCatL—mature在體外能降解BSA,不水解人IgG和血紅蛋白。 Meb、Alb和Tem對(duì)rCsCatL—mature酶活性沒(méi)有任何抑制作
14、用,F(xiàn)enb和Pra有15%左右輕度抑制作用。 4.CsCatL為華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)分泌/排泄物的鑒定及在成蟲(chóng)、囊蚴和尾蚴的組織定位 Western blot結(jié)果顯示感染肝吸蟲(chóng)的陽(yáng)性血清能識(shí)別rCsCatL—promature,而anti—rCsCatL—promature血清僅識(shí)別出ESPs一條帶,該條帶位置雖然不在CsCatL分子量附近,但接近理論成熟肽分子量,說(shuō)明CsCatL是成蟲(chóng)的分泌/排泌物。 RT—P
15、CR結(jié)果顯示CsCatL基因在囊蚴和尾蚴階段均有表達(dá)。 熒光免疫組化結(jié)果顯示CsCatL在成蟲(chóng)定位于腸支,在囊蚴和尾蚴定位于合胞體即皮層細(xì)胞和皮層。 5.CsCatL用于免疫學(xué)診斷效果的評(píng)價(jià) rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide檢測(cè)肝吸蟲(chóng)病人血清特異IgG,交叉反應(yīng)均很嚴(yán)重。rCsCatL—promature檢測(cè)肝吸蟲(chóng)病人血清中特異IgG1敏感性
16、高(24/24例),但與血吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、蛔、鞭、鉤感染者均有交叉反應(yīng);rCsCatL—propeptid則檢測(cè)血清中特異IgG4敏感性高(24/24例),與血吸蟲(chóng)和肺吸蟲(chóng)感染者有交叉反應(yīng)(主要是肺吸蟲(chóng))。rCsCatL—propeptid檢測(cè)101例不同感染度肝吸蟲(chóng)病人血清中特異IgG4的陽(yáng)性檢出率為90.1%,隨感染度增加,陽(yáng)性檢出率上升,呈現(xiàn)出一定相關(guān)性;檢測(cè)重度以上感染者陽(yáng)性檢出率高于輕度感染者(P<0.05)。 6.Cs
17、CatL免疫保護(hù)作用 rCsCatL—promature、rCsCatL—mature、rCsCatL—propeptide免疫大鼠后,血清中特異性IgG水平顯著升高,至初次免疫后6w達(dá)高峰,以IgG1和IgG2為主;在血清特異性IgG效價(jià)高于1:102,400,進(jìn)行肝吸蟲(chóng)囊蚴攻擊感染,感染后第70天殺鼠。免疫組與對(duì)照組的EPG和成蟲(chóng)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異,說(shuō)明終宿主經(jīng)CsCatL免疫后對(duì)囊蚴感染無(wú)免疫保護(hù)作用。
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