華支睪吸蟲轉(zhuǎn)錄和代謝酶相關(guān)基因的表達(dá)及生物學(xué)活性初步鑒定.pdf

1、本次研究利用生物信息學(xué)方法,對華支睪吸蟲eDNA文庫的EST序列進(jìn)行大規(guī)模同源性分析和Unigene拼接,篩選出RPEF(RNA polymeraseⅡ elongation factor)、TC(Transcriptional coactivator)、GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)三個基因作為本次研究對象,其研究內(nèi)容主要包括:對華支睪吸蟲cDNA文庫所有ESTs 5'端

2、測序結(jié)果和3'端測序結(jié)果,通過Wu-Blast程序進(jìn)行Unigene歸并,同時使用phrap軟件對克隆進(jìn)行序列拼接.使用NCBI上的Blastx程序?qū)ふ彝吹鞍?預(yù)測編碼蛋白的生物學(xué)功能.使用PCGENE軟件、Antheprot-5軟件和ExPASy程序分析編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)特征及搜尋功能性位點(Site)、功能性結(jié)構(gòu)域(Domain),Swiss-model進(jìn)行蛋白三維模建.采用PCR方法從成蟲cDNA文庫中擴(kuò)增出RPEF基因、TC基

3、因并測序鑒定.將CsRPEF基因、CsTC基因分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和PET-30a(+),經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定重組子是否正確.將重組子pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH(前期工作)和PET-TC在大腸桿菌BL21系統(tǒng)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行大規(guī)模表達(dá).對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析,檢測重組蛋白分子量是否與預(yù)測值一致.使用GST的單抗和抗華支睪吸蟲免疫兔血清進(jìn)行Western blot免

4、疫識別,鑒定重組蛋白pGEX-4T-1-RPEF和PET-TC是否正確表達(dá)和具有免疫學(xué)活性.分別使用Novagen公司的GST·Bind<'TM>kit和His·Bind<'TM>purification kit按照操作說明親和純化重組蛋白pGEX-4T-1-RPEF、pGEX-4T-1-GAPDH和PET-TC,并使用thrombin凝血酶對經(jīng)GST親和層析柱純化的融合蛋白GST-RPEF、GST-GAPDH進(jìn)行酶切,Wash buf

5、fer再次過柱洗脫.分別對純化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、PET-TC進(jìn)行SDS-PAGE分析和凝膠掃描分析,鑒定重組蛋白純化效果和含量.采用Bradford法對所獲得的純化蛋白CsRPEF、CsGAPDH、CsTC的濃度分別進(jìn)行測定.上述實驗結(jié)果表明此次實驗所獲得的純化蛋白可以很好的用于后續(xù)的基因生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)的實驗室鑒定.將純化的目的蛋白CsRPEF、CsTC、CsGAPDH分別免疫BALB/C小鼠,40天后制備其免疫蛋白抗

6、血清.采用間接ELISA法檢測抗血清IgG抗體滴度及抗體產(chǎn)生的情況,同時采用Western blot免疫識別來鑒定制備的抗血清抗三種目的蛋白的特異性.采用S-P濃縮型免疫組化三步法對CsRPEF、CsTC、CsGAPDH三基因在華支睪吸蟲成蟲中的組織分布進(jìn)行定位,同時采用熒光免疫定位法對Cs GAPDH基因在華支睪吸蟲成蟲和免疫小鼠中的分布和表達(dá)情況進(jìn)一步加以確證.采用GAPDH的通用底物3-GAP(三磷酸甘油醛)反應(yīng)體系來鑒定純化蛋白

7、CsGAPDH的酶催化活性.選擇不同3-GAP濃度,測定GAPDH與催化底物轉(zhuǎn)化量之間關(guān)系.選擇不同的競爭性抑制劑AMP的濃度作用于酶反應(yīng)體系,測定AMP對催化底物轉(zhuǎn)化量NADH的影響,依據(jù)5分鐘之內(nèi)不同時間點的光密度值(ABS),計算重組蛋白CsGAPDH酶活力單位.本文通過生物信息學(xué)方法從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫中篩選出了RNA聚合酶Ⅱ延長因子(RNA polymerase Ⅱ elongation factor)、轉(zhuǎn)錄激活因子(

8、transcriptional coactivator)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)基因,成功將三個基因予以克隆,表達(dá),酶切、純化,動物免疫實驗獲取了三個重組蛋白的抗血清,免疫組織化學(xué)法對三個基因在華支睪吸蟲成蟲中的組織分布分別進(jìn)行了定位,并完成了重組蛋白CsGAPDH酶催化活性的初步測定.上述研究結(jié)果可為更深入地分析這三個基因的生物學(xué)功能以及華支睪吸蟲病理想