NFAT1在膠質(zhì)瘤中的表達及意義研究.pdf

1、前言
　　研究表明，活化T細胞核因子(thenuclearfactorofactivatedTcells,NFAT)家族成員在許多人類惡性病變中具有腫瘤轉(zhuǎn)型功能。NFAT1是該家族的一個重要成員，其活化既能夠誘導T細胞的活化和增殖，又能夠通過上調(diào)FasL表達，在成熟T細胞中引起“活化誘導的細胞死亡”(activation-inducedcelldeath，AICD)。據(jù)報道，NFAT1和眾多腫瘤細胞的存活、凋亡、遷移及侵襲相關(guān)，而

2、NFAT1在膠質(zhì)瘤中的研究尚屬空白。我們以往實驗顯示，在多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)中，白介素-13受體α2亞單位的表達增高受NFAT1調(diào)控，因此我們推測，NFAT1可能在GBM中表達上調(diào)并且活化。如同在T細胞和其他腫瘤中，在膠質(zhì)瘤細胞中，NFAT1也可能調(diào)節(jié)增殖及侵襲。而影響NFAT1活性的藥物可能對膠質(zhì)瘤產(chǎn)生影響。此外，由于NFAT1與免疫系統(tǒng)聯(lián)系緊密，對NFAT1的研究可能成為連接膠質(zhì)瘤化療和免疫治療的紐帶。本研究旨在探討NFAT

3、1在不同級別膠質(zhì)瘤中的表達情況和作用，以及相關(guān)的分子機制。
　　材料和方法
　　1、mRNA芯片分析
　　利用中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜計劃111例臨床膠質(zhì)瘤標本mRNA表達Microarray數(shù)據(jù)庫，運用聚類分析法，考察NFAT1在膠質(zhì)瘤中的表達情況。運用聚類分析和Pearson相關(guān)分析，考察NFAT1mRNA表達與侵襲相關(guān)基因表達、Fas表達的關(guān)系。
　　2、RT-PCR
　　通過RT-PCR進一步驗證NF

4、AT1在24例GBM及GBMU87、U251細胞系中的表達。通過RT-PCR考察NFAT1基因敲除對侵襲相關(guān)基因表達的影響。
　　3、免疫組織化學染色及免疫熒光染色
　　通過免疫組織化學染色法，在50例膠質(zhì)瘤（25例GBM和25例星形細胞瘤）中考察NFAT1的表達和細胞內(nèi)定位情況。通過免疫熒光染色，在U87細胞中，考察NFAT1的表達和活性，以及環(huán)孢素(CsA)、FK506、PMA和離子霉素對NFAT1活性的影響。
　

5、　4、NFAT1基因沉默
　　運用shRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，在U87、U251細胞中穩(wěn)定敲除NFAT1表達。通過RT-PCR及westernblot檢測基因沉默效果。
　　5、細胞增殖實驗
　　通過MTT實驗及細胞計數(shù)檢測細胞增殖情況，明確NFAT1基因沉默對細胞增殖的影響，以及CsA、FK506、PMA和離子霉素對GBM細胞增殖的影響。
　　6、體外侵襲實驗
　　通過TranswellMatrigel實驗檢測細

6、胞侵襲力。明確NFAT1基因沉默對細胞侵襲力的影響，以及CsA和FK506對GBM細胞侵襲力的影響。
　　7、碘化丙啶染色流式細胞儀
　　通過碘化丙啶(PI)染色流式細胞儀檢測細胞周期、細胞死亡情況。明確NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對GBM細胞周期、細胞死亡的影響。
　　8、透射電鏡
　　通過透射電鏡形態(tài)學觀察，檢測PMA和離子霉素對GBM細胞、染色質(zhì)、細胞核形態(tài)的影響。定性分析PMA和離子霉素對GBM

7、細胞凋亡的影響。
　　9、TUNEL實驗
　　運用TUNEL實驗定量分析NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對GBM細胞凋亡的影響。
　　10、Real-timePCR和Westernblot
　　運用real-timePCR和westernblot檢測NFAT1基因沉默以及PMA和離子霉素對GBM細胞Fas/FasL表達的影響。
　　11、統(tǒng)計學分析
　　芯片分析獲得的mRNA表達數(shù)據(jù)用于聚類分析

8、和Pearson相關(guān)分析。聚類分析采用averagelinkage層次聚類法，聚類分析結(jié)果用TreeView軟件顯示?？ǚ綑z驗及t檢驗用于檢測差異顯著性。所有數(shù)據(jù)由至少三次實驗得到的均數(shù)±標準差表示。雙尾P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果
　　1、NFAT1在GBM臨床標本和細胞系中高表達
　　mRNA芯片分析顯示，和低級別膠質(zhì)瘤相比，NFAT1在GBM中高表達。RT-PCR進一步證實NFAT1在GBM臨床標本及

9、U87、U251細胞中高表達。免疫組織化學染色顯示，在星形細胞瘤中，NFAT1表達水平較低;在GBM中，NFAT1高表達，并且位于細胞核內(nèi)。
　　2、NFAT1在GBM細胞中活化且有不同的活化程度
　　免疫熒光染色顯示，NFAT1在U87、U251細胞中高表達，并且主要位于細胞核內(nèi)，處于活化狀態(tài)，而CsA和FK506能夠抑制NFAT1活性;PMA和離子霉素則能夠進一步激活NFAT1，使其處于過度激活狀態(tài)。
　　3、NF

10、AT1活性抑制或表達下調(diào)能夠降低GBM細胞侵襲力
　　TranswellMatrigel實驗顯示，藥物抑制NFAT1活性，或者特異性敲除NFAT1表達，能夠明顯降低U87細胞的侵襲力。
　　4、NFAT1活性抑制或表達下調(diào)對GBM細胞增殖無明顯影響
　　MTT實驗證實，藥物抑制NFAT1活性，或者特異性敲除NFAT1表達對U87細胞增殖無明顯影響。PI染色流式細胞顯示NFAT1基因沉默對U87細胞周期無明顯影響。

11、>　　5、在GBM中NFAT1表達和Cox-2，MMP-7，MMP-9表達相關(guān)
　　利用111例膠質(zhì)瘤mRNAmicroarray數(shù)據(jù)，采用聚類分析及Pearson相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達與侵襲相關(guān)基因Cox-2、MMP-7、MMP-9表達明顯相關(guān)。RT-PCR證實，NFAT1基因敲除明顯抑制Cox-2、MMP-7、MMP-9表達。
　　6、PMA和離子霉素抑制GBM細胞增殖
　　MTT實驗及細胞計

12、數(shù)顯示，加入PMA和/或離子霉素后，U87及U251細胞增殖顯著降低（P＜0.05）。
　　7、PMA和離子霉素誘導GBM細胞凋亡
　　透射電鏡形態(tài)學觀察顯示，加入PMA和離子霉素后，GBM細胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學特征;TUNEL實驗證實，加入PMA和/或離子霉素后，GBM細胞凋亡明顯增多。
　　8、PMA和離子霉素誘導GBM細胞周期阻滯和細胞死亡
　　PI染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，加入PMA和離子霉素后，GBM細

13、胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期細胞周期阻滯，sub-G0期成分增多。
　　9、在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達和Fas表達相關(guān)
　　利用111例膠質(zhì)瘤mRNAmicroarray數(shù)據(jù)，采用聚類分析及Pearson相關(guān)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中NFAT1表達與Fas表達明顯相關(guān)。
　　10、下調(diào)NFAT1表達阻礙PMA和離子霉素誘導GBM細胞死亡
　　MTT實驗和細胞計數(shù)顯示，NFAT1基因沉默降低PMA和離子霉素對GBM細胞增

14、殖的抑制作用;TUNEL實驗證實，NFAT1基因沉默抑制PMA和離子霉素誘導的GBM細胞凋亡;PI染色流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，NFAT1基因沉默抑制PMA和離子霉素誘導的GBM細胞周期阻滯及細胞死亡。
　　11、PMA和離子霉素通過NFAT1上調(diào)FasL表達
　　Real-timePCR和westernblot顯示，在GBM細胞中，PMA和離子霉素明顯上調(diào)Fas/FasL表達;而NFAT1基因沉默明顯抑制PMA和離子霉素誘導的F

15、asL表達。
　　12、中和FasL抑制PMA和離子霉素誘導的GBM細胞凋亡
　　TUNEL實驗顯示，使用特異性抗體中和FasL明顯抑制PMA和離子霉素誘導的GBM細胞凋亡。
　　結(jié)論
　　1.NFAT1在GBM細胞中表達上調(diào)。
　　2.在GBM細胞中，NFAT1具有不同的活化程度，普通活化和過度激活。
　　3.普通活化時，NFAT1能夠調(diào)節(jié)GBM細胞的侵襲性。
　　4.當NFAT1被PMA和/