膠質瘤中Rac1蛋白表達和其在惡性膠質瘤侵襲中作用的研究.pdf

1、惡性膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，約占成人顱內腫瘤的30％～50％。近年來，盡管惡性膠質瘤的治療已得到了值得關注的發(fā)展，但是惡性膠質瘤病人的預后并沒有得到明顯改善，膠質母細胞瘤患者的中位生存時間仍不足15個月[1]。惡性膠質瘤分化程度差、缺乏凋亡、富含血管、增殖活性高和呈侵襲性生長。其中侵襲性生長是惡性膠質瘤最突出的生物學行為之一，也是導致腫瘤復發(fā)、遠隔遷移和難以治愈的主要原因[2]。小部分具有極強遷移和侵襲能力的腫瘤細胞早期即向腫

2、瘤周圍及正常腦組織浸潤，在遠離原發(fā)灶處形成大量的微腫瘤，從而免于手術切除和放射暴露[3]。研究認為這些細胞即是腦腫瘤干細胞[4]。
　　惡性膠質瘤的侵襲遷移是腫瘤細胞與宿主細胞及細胞外基質相互作用的復雜過程。腫瘤細胞的侵襲過程一般可分為三個步驟，首先在黏附分子的介導下粘附于細胞外基質(ECM)；在基質金屬蛋白酶(MMPs)等作用下降解ECM；通過旁分泌和自分泌的一些因子下細胞肌動蛋白骨架發(fā)生重組，形成偽足遷移運動[5]。其中，細胞

3、的遷移運動是其關鍵環(huán)節(jié)。細胞的遷移運動由多種信號分子調控，其中肌動蛋白骨架及其調控蛋白最為重要[6][7]。當細胞運動時，肌動蛋白骨架發(fā)生動態(tài)重組形成片狀偽足，為細胞運動提供必要的力量[8]。Rac1是重要肌動蛋白骨架調控蛋白，控制板狀偽足的形成。Rac1激活其下游效應因子，并和這些效應因子共同轉運至細胞運動前端的細胞膜下，誘導肌動蛋白骨架重組，產(chǎn)生片狀偽足，從而促進細胞運動。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Rac1在乳腺癌、結腸癌及卵巢癌中表達均明顯增高

4、，且其高表達與腫瘤的侵襲轉移密切相關[11-13]。
　　本課題主要討論Rac1在膠質瘤組織中的表達及分布特點；對膠質瘤細胞遷移和侵襲的調節(jié)；以及其陽性細胞與膠質瘤干細胞的聯(lián)系，Rac1在腦膠質瘤干細胞遷移和侵襲中的作用，分為以下三個部分：
　　1.Rac1在膠質瘤中的表達及其分布特征。為探討膠質瘤細胞的遷移方式及Rac1的表達與膠質瘤病理分級的相關性，我們收集2009年6月到2010年6月新診斷的65例人腦膠質瘤標本，每份

5、標本通過術中導航精確的選取了腫瘤中心組織、腫瘤和水腫交界區(qū)組織，進行免疫組織化學染色和western blot分析。Western blot結果發(fā)現(xiàn)正常對照腦組織中Rac1不表達或呈低表達，惡性膠質瘤中Rac1的表達水平顯著提高(F=41.18，P<0.0001)；免疫組織化學染色檢測發(fā)現(xiàn)，Rac1在不同病理級別膠質瘤中的表達差異有統(tǒng)計學意義(H=34.935，P=0.000)，Rac1的表達與膠質瘤的分級呈正相關(rs=0.682，P

6、<0.01)，膠質母細胞瘤實體區(qū)、腫瘤與腦組織交界區(qū)均有陽性細胞染色。在膠質母細胞瘤交界區(qū)Rac1陽性細胞在血管周圍呈放射狀和平行于白質纖維束分布。
　　2.Rac1在SDF-1誘導人腦膠質瘤細胞遷移和侵襲中的作用。我們通過特異性的Rac1活性抑制劑下調Racl的活性，探討Rac1在基質細胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)誘導的人惡性膠質瘤細胞遷移和侵襲中的作用。取U251細胞分

7、為三組，NSC23766預處理組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時后，于無血清培養(yǎng)基中加入NSC23766(終濃度為100μmol/L)預處理3h后，給予SDF-1(100nmol/ml)處理3min；SDF-1處理組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時，于無血清培養(yǎng)基中加入20μl PBS替代NSC23766孵育3h后，給予SDF-1(100nmol/ml)處理3min；對照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時，于無血清培養(yǎng)基中加入20μl PBS替代NSC2376

8、6孵育3h后，給予20μl PBS替代SDF-1對照處理；倒置相差顯微鏡下觀察各組U251細胞的形態(tài)變化；細胞遷移實驗和Transwell細胞侵襲實驗評價不同處理組U251細胞遷移和侵襲能力的差別；Rac1活性實驗和Western blotting分別檢測不同處理組U251細胞中GTP-Rac1、總Rac1蛋白及其下游蛋白的表達水平；免疫熒光法檢測不同處理組U251細胞中偽足形成、Rac1的表達及其細胞內定位。結果：對照組比較，SDF-

9、1(100nmol/ml)刺激細胞伸出巨大的片狀偽足；SDF-1處理組細胞遷移和侵襲能力明顯強于對照組細胞(P<0.05)；SDF-1對細胞內Rac1活化有明顯的刺激作用(P<0.05)，并且細胞運動前端的胞膜下可見Rac1蛋白聚集。Rac1抑制劑NSC23766(100μmol/L)對SDF-1誘導的片狀偽足形成有顯著的抑制作用；Rac1抑制劑NSC23766對SDF-1誘導的細胞遷移和侵襲有顯著的抑制作用(P<0.05)；與SDF-

10、1處理組比較，NSC23766預處理組細胞內Rac1活性明顯降低(P<0.05)，且細胞運動前端的胞膜下未見Rac1蛋白聚集。三組中總Rac1蛋白的表達水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。
　　3.Rac1陽性細胞與膠質瘤干細胞的關系及Rac1在腦膠質瘤干細胞遷移和侵襲中的作用。免疫熒光雙染色檢測膠質瘤組織中Rac1陽性細胞與膠質瘤干細胞的關系。為進一步確定Rac1陽性細胞與膠質瘤干細胞的關系及Rac1在腦膠質瘤干細胞遷移和侵襲中的

11、作用，我們通過免疫磁珠分選法分離膠質瘤干細胞，免疫熒光CD133鑒定腫瘤干細胞；特異性的Rac1活性抑制劑NSC23766下調膠質瘤干細胞Rac1的活性；Transwell細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗評價細胞的遷移和侵襲能力；Rac1活性實驗檢測細胞中Rac1活性；Western blotting檢測細胞中hMena和MMP9蛋白的表達水平。結果：免疫熒光雙染色顯示大部分GSCs也呈Rac1陽性。成功培養(yǎng)出懸浮生長的細胞球，可以連續(xù)傳代并

12、持續(xù)表達神經(jīng)干細胞標志物CD133；Rac1活性檢測顯示：CD133+細胞中Rac1-GTP表達水平顯著高于在CD133-細胞中的表達，CD133+細胞Rac1活性明顯強于CD133-細胞(P<0.05)；與對照組比較，NSC23766處理組中GSCs的Rac1活性明顯減弱(P<0.05)。Transwell細胞遷移實驗及侵襲實驗結果顯示，CD133+細胞遷移和侵襲的能力明顯強于CD133-細胞(P<0.05)；與對照組比較，NSC23

13、766處理組GSCs遷移和侵襲的能力明顯減弱(P<0.05)。Western blotting結果顯示：與對照組比較，NSC23766處理組GSCs hMena和MMP9蛋白表達水平明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：
　　1.Rac1在對照腦組織中不表達，在不同級別膠質瘤中均有表達，表達水平隨著膠質瘤惡性程度的升高而增高。Rac1陽性細胞在惡性膠質瘤中的分布特征表現(xiàn)出了腫瘤細胞在體內的遷移方式，