結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體的構建及表達.pdf

1、結核病(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的慢性傳染病,MTB可能侵入人體全身各種器官,但主要侵犯肺,稱為肺結核。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全世界每年有1000萬新發(fā)病例,150萬人死于結核病。我國高居全球結核病高負擔國家的第二位,現(xiàn)有MTB感染人數(shù)已達4億,傳染性TB患者達到200萬。卡介苗(BCG)作為目前唯一用于預防結核病的疫苗,對于兒童重癥結

2、核病如粟粒型結核和結核性腦膜炎具有預防作用,但是對于預防成年人結核病效果不理想,保護率為0-80％不等。目前,很多國家都在研究結核新疫苗,已有200多種的候選疫苗,其中有的正在進行動物模型實驗,有的已經(jīng)進入臨床實驗。近幾十年,隨著耐藥MTB增多及HIV共感染等問題,加重了結核病的嚴重性。所以開發(fā)新型有效的結核病疫苗迫在眉睫,希望盡快開發(fā)出更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群的新型結核病疫苗。
　　 本文以廣泛使用的Ad-E

3、asy腺病毒包裝系統(tǒng)為基礎,構建結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒疫苗。首先PCR獲取結核分枝桿菌MPT83基因,然后再將MPT83基因重組于穿梭載體pAdTrack-CMV；通過化學轉化法將線性化的重組穿梭質粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架質粒(pAdEasy-1)共轉入大腸桿菌BJ5183,重組穿梭質粒和病毒骨架質粒在BJ5183發(fā)生同源重組形成重組腺病毒質粒(rAd-GFP-MPT83)；線性化的重組腺病毒質粒轉

4、染HEK293細胞,并于HEK293細胞中包裝成病毒；mRNA和蛋白水平上檢測目的基因的表達:大量擴增腺病毒,體外通過MTT實驗初步驗證重組腺病毒的免疫原性:體內(nèi)通過重組腺病毒免疫小鼠,整體熒光成像觀察報告基因綠色熒光蛋白(GFP)在小鼠體內(nèi)的表達與分布,間接跟蹤目的基因在小鼠體內(nèi)的表達情況。結果表明:
　　 (1)成功構建結核分枝桿菌MPT83重組腺病毒載體,構建的重組腺病毒載體于HEK293細胞中成功包裝腺病毒。通過RT-P

5、CR和Western-Blotting實驗,分別于mRNA和蛋白水平上檢測均表明結核分枝桿菌MPT83基因在HEK293細胞中表達。
　　 (2)MTT實驗表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更強的刺激體外淋巴細胞增殖的能力,證實了目的蛋白具有很強的刺激淋巴細胞增殖的能力,即其免疫原性。
　　 (3)小鼠活體實驗表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,報告基因GFP于免疫后第4d達到高