高通量結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達篩選平臺的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌,近年來隨著結(jié)核耐藥及結(jié)核與HIV共感染的問題越來越嚴重,結(jié)核病有死灰復(fù)燃的趨勢。對結(jié)核分枝桿菌的研究是解決結(jié)核病難題的關(guān)鍵之一,結(jié)核分枝桿菌的致病機理研究和關(guān)鍵藥物靶點的結(jié)構(gòu)與功能研究都需要重組表達信號通路中的關(guān)鍵蛋白或者藥物靶標蛋白。
  然而結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究由于受結(jié)核分枝桿菌蛋白難以可溶表達和純化的影響而進展緩慢。融合標簽技術(shù)是近年來興起的一項重組DNA技術(shù),在重組蛋白的純化

2、、促進重組蛋白的表達、幫助重組蛋白正確折疊、提高重組蛋白的可溶性及穩(wěn)定性等方面有很大的應(yīng)用價值。
  為找到能更好的表達結(jié)核分枝桿菌蛋白的重組表達系統(tǒng),解決結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達的難題,將多個能促進可溶表達的蛋白標簽與高通量的Gateway克隆技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達快速通量的篩選平臺。在保證蛋白分子量大小平均分布的前提下隨機挑選46個已知以包涵體形式表達或者不表達的結(jié)核分枝桿菌蛋白的基因,分別克隆到帶有N-末

3、端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白標簽基因的載體上,酶切驗證成功后轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)表達菌株。重組蛋白表達載體在Rosetta表達菌株中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達;采用Tricine-SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況,統(tǒng)計結(jié)核桿菌重組蛋白表達情況,比較5種蛋白融合標簽的促溶效果。
  統(tǒng)計結(jié)果表明,Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標簽均可促進結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中

4、可溶表達,其中Nus.A融合標簽促溶效果明顯優(yōu)于其他4種蛋白融合標簽;當融合Nus.A標簽蛋白基因后,可顯著促進結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中可溶表達。融合Nus.A標簽后,可溶表達的蛋白數(shù)量占總樣品數(shù)的比例提高到41%,與未融合標簽的菌株相比提高了32%;同時其他的標簽SUMO、MBP、Trx.a、ACP融合蛋白可溶表達數(shù)量占總樣本數(shù)的比例分別提高到21%、26%、26%、21%,雖然可溶蛋白比例沒有Nus.A融合蛋白高,但也均能不

5、同程度的促進結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達。
  本文成功構(gòu)建帶有N-末端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標簽基因的原核表達載體,并且與高通量的Gateway克隆技術(shù)相結(jié)合,建立了結(jié)核分枝桿菌重組蛋白可溶表達的快速通量篩選平臺。本研究構(gòu)建的載體引入了Gateway反應(yīng)位點attR1-ccdB-attR2,克服了克隆位點不一致、重組蛋白性質(zhì)不同等原因不能高通量表達、純化異源蛋白的困難;所有結(jié)核分枝桿菌蛋白基因均

6、可采用Gateway克隆技術(shù)高通量的重組到構(gòu)建的所有載體中,所有克隆均可平行進行,且所需實驗時間很短,節(jié)省了大量的時間,實現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌蛋白基因高效克隆;此外,除MBP融合蛋白外,其余融合蛋白的N端均帶有6個組氨酸標簽(6 His),因此可以通過Ni-NTA親和層析進行純化,實現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白高效表達篩選。再者,本研究經(jīng)比較得出Nus.A蛋白融合標簽在促進結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌可溶性表達中有較好作用,為結(jié)核分枝桿菌重組蛋白

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