Ghrelin及瘦素系統(tǒng)在大鼠2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的代謝紊亂綜合癥，通常認(rèn)為肥胖是T2DM的前驅(qū)，胰島素抵抗(Insulinresistance，IR)則是二者共同的發(fā)病機(jī)制。 Ghrelin是一種主要由胃粘膜分泌的迄今為止最為強(qiáng)效的開胃肽，可以降低能量消耗、促進(jìn)脂肪堆積、增加體重。瘦素則由脂肪細(xì)胞分泌，可抑制食欲、增加能量消耗、減少脂肪堆積、減輕體重。因而二者是維持機(jī)體能量平

2、衡的一對(duì)拮抗激素。下丘腦弓狀核是Ghrelin和瘦素共同的作用位點(diǎn)，二者均可通過影響下丘腦神經(jīng)肽Y(NeuropeptideY，NPY)的合成與分泌來調(diào)節(jié)能量代謝。 諸多研究認(rèn)為瘦素系統(tǒng)在IR、T2DM的形成中起重要作用：高瘦素血癥與瘦素抵抗可誘發(fā)高胰島素血癥進(jìn)而導(dǎo)致IR和T2DM。最近研究發(fā)現(xiàn)肥胖與T2DM患者空腹血漿ghrelin水平顯著降低，與體重指數(shù)、空腹胰島素水平及IR程度呈負(fù)相關(guān)；低ghrelin血癥是IR、T2DM

3、發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示ghrelin可能也參與了IR、T2DM的形成。 與瘦素系統(tǒng)相比，Ghrelin系統(tǒng)與T2DM關(guān)系的研究還很少，主要局限于T2DM患者血循環(huán)中g(shù)hrelin濃度的變化。T2DM發(fā)生過程中(正?！鶬R→T2DM)ghrelin及其受體的變化國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。 本研究在傳統(tǒng)造模方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，成功建立了T2DM大鼠模型，同時(shí)取模型形成過程中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(正常、DIO4W、DIO8W、T2DM)，

4、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Reversetranscriptionpoly-merasechainreaction，RT-PCR)、凝膠電泳半定量RT-PCR法、免疫組化法(Immunohistochemistry，IHC)、放射免疫法(Radioimmunoassay，RIA)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，EIA)、等；從分子與蛋白兩個(gè)水平以及外周(胃、脂肪組織)、循環(huán)

5、、中樞(下丘腦弓狀核)三個(gè)層面，對(duì)ghrelin與瘦素系統(tǒng)在T2DM大鼠模型形成過程(正?！鶬R→T2DM)中的變化及相互關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)研究。旨在觀察T2DM形成過程中瘦素系統(tǒng)與ghrelin系統(tǒng)的改變及其與IR的關(guān)系。本研究共分四部分。 方法 12型糖尿病大鼠模型的建立 本實(shí)驗(yàn)以改良的高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)法建立T2DM大鼠模型。 雄性SD大鼠(200g左右)1

6、10只，15只作為正常對(duì)照喂以基礎(chǔ)飼料，95只喂以高脂飼料(在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上加10％豬油，2％膽固醇)。4周(Week，W)時(shí)將體重超過正常對(duì)照組最高體重者(45只)納入食源性肥胖組(Diet-inducedobese，DIO)，余者淘汰，該時(shí)間點(diǎn)設(shè)為DIO4W；繼續(xù)喂以高脂飼料4W(此時(shí)間點(diǎn)設(shè)為DIO8W)，隨機(jī)挑選15只大鼠，腹腔注射小劑量STZ(15mg/kg)，10天后測(cè)空腹血糖(Fastbloodglucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)

7、BG大于正常大鼠均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(本研究確定該值為7.8mmol/L)、胰島素敏感性降低，且上述指標(biāo)能維持3W者納入T2DM組(15只大鼠全部成模)。 每周測(cè)體長(zhǎng)，稱體重，計(jì)算Lee's指數(shù)(反應(yīng)大鼠肥胖程度)，分別于DIO4W、DIO8W、T2DM時(shí)應(yīng)用高胰島素正常葡萄糖鉗夾技術(shù)和胰島素敏感指數(shù)(Insulinsensitivityindex，ISI)來評(píng)價(jià)胰島素敏感性，同時(shí)宰殺動(dòng)物稱量腹腔脂肪組織濕重、檢測(cè)FBG以及空腹血清

8、總膽固醇、甘油三酯、胰島素濃度。 2瘦素及其受體與2型糖尿病動(dòng)物模型的形成 取模型形成過程中4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(正常、DIO4W、DIO8W、T2DM)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法定量檢測(cè)脂肪組織瘦素mRNA表達(dá)水平；RIA法檢測(cè)空腹血清瘦素濃度；凝膠電泳半定量RT-PCR法、IHC法檢測(cè)下丘腦長(zhǎng)型瘦素受體(Obesityreceptor，OB-Rb)mRNA表達(dá)水平及下丘腦弓狀核OB-Rb免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平。觀察瘦素及其

9、受體在T2DM大鼠模型形成過程中的變化。 3Ghrelin及其受體與T2DM動(dòng)物模型的形成 取模型形成過程中四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(正常、DIO4W、DIO8W、T2DM)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法、IHC法、EIA法檢測(cè)胃粘膜組織ghrelinmRNA、ghrelin免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平及胃組織勻漿ghrelin含量；EIA法檢測(cè)空腹血漿ghrelin濃度；凝膠電泳半定量RT-PCR法、IHC法檢測(cè)下丘腦及下丘腦弓狀核ghr

10、elin受體(Growthhormonesecretagoguereceptor，GHSR)mRNA、GHSR-1α免疫陽性細(xì)胞表達(dá)水平。觀察ghrelin及其受體在T2DM大鼠模型形成過程中的變化。 4NPY在T2DM動(dòng)物模型形成中的作用 取模型形成過程中四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(正常、DIO4W、DIO8W、T2DM)，應(yīng)用凝膠電泳半定量RT-PCR法、IHC法檢測(cè)下丘腦NPYmRNA及下丘腦弓狀核NPY免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)水平。

11、 結(jié)果 1 與正常組比較，DIO4W、DIO8W及T2DM組的體重與Lee's指數(shù)分別增加50％與2.97％、106％與4.88％、125％與5.89％；血清總膽固醇與甘油三酯則增加43％與58％、121％與138％、174％與256％；脂肪濕重分別是正常組的239％、366％、418％；空腹血清胰島素值則是正常組的115％、147％、192％；GIR值分別是正常組的80％、60.76％、49.21％；正常、DIO

12、4W、DIO8W、T2DM四組ISI值分別為-4.50±0.13、-4.66±0.08、-4.94±0.12、-5.64±0.10。 2 DIO4W、DIO8W及T2DM各組大鼠脂肪組織瘦素mRNACt值分別為正常組的3.48(3.05～3.98)、7.03(8.06～6.14)、8.40(6.44～10.96)倍，呈遞增趨勢(shì)；空腹血清瘦素濃度(ng/ml)分別為0.33±0.05，0.39±0.05和0.47±0.07

13、，均明顯高于對(duì)照組(0.26±0.04，P＜0.01)，呈遞增趨勢(shì)；下丘腦OB-Rb的mRNA水平(相對(duì)灰度值)分別為15.05±6.22，5.97±2.19和5.23±1.60均明顯低于對(duì)照組(30.24±10.99，P＜0.01)呈遞減趨勢(shì)；OB-Rb陽性細(xì)胞染色的積分光密度值(Opticaldensity，OD)值逐漸減少(0.M±0.01、0.12±0.02、0.08±0.01、0.07±0.01)，呈遞減趨勢(shì)(P＜0.01)。

14、 3 DIO4W、DIO8W及T2DM組大鼠胃組織ghrelinmRNA的表達(dá)分別為正常組的83.2％(72.7％～95.1％)、65.2％(59.3％～71.8％)、60.8％(58.1％～63.6％)，呈遞減趨勢(shì)；胃組織ghrelin(ng/mg蛋白)濃度分別為0.67±0.11，0.57±0.11和0.52±0.10，均明顯低于對(duì)照組(0.81±0.11，P＜0.01)，呈遞減趨勢(shì)；正常、DIO4W、DIO8W、T

15、2DM四組胃組織ghrelin免疫陽性細(xì)胞染色的OD值分別為0.16±0.01、0.13±0.01、0.12±0.01、0.10±0.02，呈遞減趨勢(shì)(P＜0.01) 4 DIO4W、DIO8W及T2DM組NPYmRNA表達(dá)水平(相對(duì)灰度值)分別為1.15±0.16，1.51±0.14和1.78±0.14，均明顯高于對(duì)照組(0.86±0.14，P＜0.01)，呈遞增趨勢(shì)；正常對(duì)照組、DIO4W、DIO8W及T2DM組NP

16、Y陽性細(xì)胞染色的OD值分別為：0.17±0.01、0.20±0.02、0.25±0.05、0.35±0.05，呈遞增趨勢(shì)(P＜0.01)。 結(jié)論 1在傳統(tǒng)造?；A(chǔ)上加以改良-選擇DIO大鼠作為T2DM造模對(duì)象，使造模成功率達(dá)100％。隨著T2DM動(dòng)物模型的形成，體重、體脂、血清總膽固醇、甘油三酯、胰島素濃度及IR程度均呈遞增趨勢(shì)。 2隨著T2DM動(dòng)物模型的形成，大鼠脂肪組織瘦素的生成、循環(huán)中瘦素的濃度呈遞增趨勢(shì)，

17、下丘腦OB-Rb的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，提示瘦素在下丘腦的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙，受體的減少將促使瘦素代償性分泌增加，引起高瘦素血癥與瘦素抵抗。后者又可導(dǎo)致高胰島素血癥，加重IR，促進(jìn)T2DM的形成。 3隨著T2DM動(dòng)物模型的形成，大鼠胃組織ghrelin的生成、循環(huán)中g(shù)hrelin的濃度及下丘腦弓狀核GHSR的表達(dá)均呈遞減趨勢(shì)，而且與體重、體脂、循環(huán)中胰島素和瘦素的濃度以及IR程度呈負(fù)相關(guān)。提示ghrelin分泌減少可能是機(jī)體對(duì)能量正平衡