DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　乳腺癌發(fā)病率居世界女性腫瘤的第一位，嚴(yán)重危害女性身心健康。目前全球每年約有120萬(wàn)婦女患病，50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。近年來(lái)我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，并且發(fā)病年齡有所下降。因此乳腺癌的防治成為腫瘤研究的重要課題。DLC-1（Deletedinlivercancer-1）是一抑癌基因，在肝癌及其他惡性腫瘤如乳腺癌等常呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。DLC-1具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。它的失活將會(huì)引起生物學(xué)過(guò)程的改變并導(dǎo)

2、致惡性表型。DLC-1蛋白含有四個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：Rho-GAP（RhoGTPaseactivatingproteins）結(jié)構(gòu)域、SAM（sterileαmotif）結(jié)構(gòu)域、START（steroidogenicacuteregulatoryproteinrelatedlipid-transferdomain）結(jié)構(gòu)域和SR(serine-richregion)結(jié)構(gòu)域。DLC-1的主要功能結(jié)構(gòu)域是Rho-GAP結(jié)構(gòu)域，通過(guò)調(diào)控Rho蛋白的活

3、性抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。DLC-1基因失活可使Rho蛋白過(guò)度激活，從而向細(xì)胞內(nèi)持續(xù)傳遞生長(zhǎng)信號(hào),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展加速。
　　抑癌基因失活的機(jī)制主要包括遺傳學(xué)改變和表觀遺傳學(xué)改變。啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化是某些抑癌基因失活的原因之一。CpG島的異常甲基化往往早于細(xì)胞的惡性增生，基因組的甲基化往往伴隨癌癥的發(fā)生而出現(xiàn)，并隨腫瘤的惡性程度增加而增加，因此對(duì)DNA甲基化的檢測(cè)可用于腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估，也是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。
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4、LC-1基因在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，因此，探討該基因在乳腺瘤中失活的機(jī)制尤為重要。基于目前已證實(shí)的DLC-1啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島的現(xiàn)象，研究抑癌基因DLC-1啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)、及其與乳腺癌的相關(guān)性，對(duì)于理解乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制有一定的幫助。
　　目的:
　　探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)的可能的機(jī)制，檢測(cè)DLC-1啟動(dòng)子區(qū)CpG島是否存在甲基化現(xiàn)象，研究去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5

5、-Aza-CdR)對(duì)MCF-7細(xì)胞DLC-1mRNA及蛋白表達(dá)量的影響，并觀察5-Aza-CdR處理后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。建立DLC-1過(guò)表達(dá)MCF-7細(xì)胞模型，并應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)DLC-1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7細(xì)胞骨架形成的影響。
　　方法:
　　1)提取人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的基因組DNA，Bisulfite處理后用甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)其DLC-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況。
　　2)不

6、同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)處理的MCF-7乳腺癌細(xì)胞，觀察藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，并通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)觀察5-Aza-CdR處理后對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。
　　3)通過(guò)Real-TimePCR、RT-PCR、Westernblot技術(shù)檢測(cè)在不同濃度5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)處理的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中DLC-1的表達(dá)情況。
　　4)應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體將DLC-1/pcDNA3.1/N

7、v5-DESTTM轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，建立DLC-1過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，運(yùn)用免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞骨架受該基因的影響。
　　結(jié)果:
　　1)通過(guò)MSP法驗(yàn)證了在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中確實(shí)存在DLC-1基因啟動(dòng)子的甲基化。
　　2)去甲基化藥物5-Aza-CdR處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7,應(yīng)用RT-PCR和Real-timePCR、WesternBlot方法檢測(cè)DLC-1mRNA及蛋白的表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用去甲基化藥物組的細(xì)

8、胞比未經(jīng)藥物處理的MCF-7細(xì)胞DLC-1的表達(dá)量明顯增加，且10μmol/L劑量組的表達(dá)強(qiáng)度最高。
　　3)應(yīng)用去甲基化藥物5-Aza-CdR處理MCF-7細(xì)胞，觀察到去甲基化藥物能使細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移速度減緩，藥物處理后的細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變圓，突起回縮。
　　4)過(guò)表達(dá)DLC-1基因能夠影響細(xì)胞骨架的形成。DLC-1過(guò)表達(dá)的MCF-7細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)經(jīng)FITC-Phalloidin染色顯示，細(xì)胞胞漿中的微絲較野生型

9、MCF-7細(xì)胞明顯減少，極性消失，呈粗顆粒狀不連續(xù)分布在細(xì)胞周邊，局部收縮聚集成團(tuán)并形成空泡狀結(jié)構(gòu),并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓變大，突起回縮。
　　結(jié)論:
　　1)抑癌基因DLC-1的啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是導(dǎo)致該基因低表達(dá)的原因之一。
　　2)5-Aza-CdR能逆轉(zhuǎn)DLC-1基因甲基化狀態(tài)。
　　3)5-Aza-CdR能使細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移速度減緩，藥物處理后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞變圓，突起回縮。
　　4)恢