TET1對乳腺癌MCF-7細胞系生物學行為的影響.pdf

1、第一部分：構建低表達TET1的MCF-7細胞株
　　目的：乳腺癌近些年來的發(fā)病率逐年升高，其治療形成了以手術、化療、內分泌治療、放療、靶向治療及生物治療為主的綜合治療。然而，乳腺癌的致死率依舊高居女性惡性腫瘤死亡率的第三位。這其中，有超過90％的死亡是由于腫瘤的復發(fā)轉移引起的。因此，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉移機制一直是研究熱點。有研究表明，10-11異位蛋白（ten-eleven translocation1，TET1）作為促D

2、NA去甲基化過程中的重要蛋白，可以催化5-甲基胞嘧啶（5mC）轉化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），實現DNA去甲基化和基因表達的調控。
　　因此，本研究以人乳腺癌MCF-7細胞株為模型，通過沉默TET1基因表達，研究TET1對MCF-7細胞生物學行為的影響，以期為腫瘤的臨床診治提供新的靶點。
　　材料與方法：應用慢病毒轉染方法，構建TET1低表達的穩(wěn)轉細胞株（MCF-7-siTET1）以及攜帶eGFP的陰性對照穩(wěn)轉細胞株（M

3、CF-7-negative control,MCF-7-NC），運用SYBR Green法實時熒光定量PCR檢測TET1在轉錄水平的表達，Western blot法檢測TET1在蛋白水平的表達。
　　結果：成功建立低表達TET1的MCF-7細胞模型（MCF-7-siTET1），用 SYBR Green法實時定量 PCR檢測 TET1的表達，結果示，在MCF-7-siTET1中，與 MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1細

4、胞中 TET1表達下降，差異有統計學意義（P<0.001）；Western blot法檢測TET1表達，應用 Image J掃描其灰度值，結果表明，與 MCF-7-NC組相比， MCF-7-siTET1細胞中TET1表達下降，差異有統計學意義（P<0.01）。
　　結論：成功構建沉默TET1的MCF-7-siTET1穩(wěn)轉細胞株模型。
　　第二部分：TET1對乳腺癌MCF-7細胞系生物學行為的影響
　　目的：10-11異

5、位蛋白（ten-eleven translocation1，TET1）在DNA去甲基化過程中發(fā)揮重要作用，可通過催化5mC轉化為5hmC實現DNA去甲基化和基因表達的調控。有研究指出，TET1基因的突變與多種實體瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉移密切相關，但其作用機制有待進一步研究。
　　因此，本研究探究TET1對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的影響，并通過實驗初步探究TET1影響的相關分子機制，以期為腫瘤的臨床診治提供新的思路

6、。
　　材料與方法：
　　1.倒置顯微鏡下觀察轉染細胞形態(tài)，以MCF7-NC作為陰性對照組，以MCF-7作為空白對照組，運用CCK-8法檢測沉默TET1對MCF-7細胞增殖的影響，利用細胞劃痕實驗、TranswellTM檢測TET1對細胞遷移、侵襲能力的作用，最后應用 Western blot檢測 TET1與 EMT相關蛋白（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin）分子的表達。

7、>　　2.應用SPSS13.0統計軟件進行實驗數據分析，兩獨立樣本的比較應用成組t檢驗分析，多組間均數的比較應用單因素方差分析，多樣本均數間的多重比較應用Tukey檢驗分析，數據運用mean±SD表示，每組實驗不少于3個獨立樣本的重復，以P<0.05為差異具有統計學意義。
　　結果：
　　1.CCK-8法檢測細胞的增殖能力， MCF-7組與MCF-7-NC組相比，細胞增殖未見明顯差異，而MCF-7-siTET1組細胞增殖能力

8、相較前兩組明顯升高（P<0.001）。平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力，MCF-7組與MCF-7-NC組相比，細胞增殖未見明顯差異，而MCF-7-siRNA組細胞增殖能力高于MCF-7-NC組和MCF-7組（P<0.0001）。
　　2.細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力，與MCF-7組及MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1組細胞的遷移能力顯著增強（P<0.01）。
　　3.TranswellTM小室檢測細胞的侵襲能

9、力，與MCF-7組和MCF-7-NC組相比，MCF-7-siTET1組細胞的侵襲能力顯著上升（P<0.0001）。
　　4.選用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)， MCF-7-NC組和MCF-7-siTET1組細胞形態(tài)無明顯變化，進一步運用Western blot法檢測EMT相關標志物：與MCF-7組和MCF-7-NC組細胞相比，MCF-7-siTET1組細胞的E-cadherin表達降低（P<0.0001），N-cadherin表達升高（