乳腺癌中miR-125b的功能研究及鼻咽癌中LATS2表達與功能研究.pdf

1、腫瘤是機體在各種致癌因素作用下,局部組織的細胞失去對生長的正常調(diào)控,導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的新生物,目前惡性腫瘤是危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段的過程,是在遺傳因素、環(huán)境因素等諸多因素相互協(xié)同作用下,多種遺傳及表觀遺傳學(xué)改變累積的結(jié)果,涉及多種癌基因的激活和/或抑癌基因的失活。盡管目前已有很多研究者對腫瘤進行了廣泛深入的研究,也取得了不少成績,但是腫瘤發(fā)生的分子機制目前仍然未能完全闡明。本研究擬從編碼基

2、因和非編碼的小分子RNA角度來分析其在鼻咽癌和乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用,從而為闡明腫瘤發(fā)生的分子機制提供理論基礎(chǔ),并為腫瘤的診斷、預(yù)后判斷以及治療提供潛在的分子靶標(biāo)和策略。
　　 第一章 miR-125b對乳腺癌細胞增殖、細胞周期的影響及其分子機制
　　 研究背景及研究目的：
　　 MicroRNA(miRNA)是一組小分子非編碼RNA,可通過與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合調(diào)控基因的表達。miRNA可通過促進R

3、NA降解、抑制mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控靶基因。預(yù)測有1/3的編碼基因受到miRNA的調(diào)控。越來越多的證據(jù)表明,miRNA的表達異常參與了多個生物學(xué)過程,如發(fā)育、細胞增殖、凋亡和分化。miRNA突變和表達異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程具有重要作用,提示miRNA可能充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色。在我們的前期工作中發(fā)現(xiàn)miR-125b在乳腺癌中表達下調(diào),本研究在此基礎(chǔ)上對miR-125b的功能進行進一步探討。
　　 研究方法：
　　

4、我們將miR-125b的前體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株MCF-7和MDA—MB-435,應(yīng)用real—time PCR和熒光原位雜交的方法驗證轉(zhuǎn)染效率,應(yīng)用MTT方法檢測細胞增殖,低密度細胞集落形成實驗檢測細胞的克隆形成能力,應(yīng)用流式細胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染后細胞周期的分布,利用microarray確定miR-125b調(diào)控的基因,熒光素酶報告系統(tǒng)進一步證實miR—125b的直接靶基因。
　　 研究結(jié)果：
　　 我們在乳腺癌細胞株MCF-7和

5、MDA-MB-435細胞中過表達miR-125b,可以顯著抑制細胞的增殖、克隆形成并引起細胞周期G1期增多,進一步進行表達譜分析和western blotting發(fā)現(xiàn)過表達miR—125b抑制MAN1B1、C9orf86、ETS1和MKNK2蛋白水平。熒光素酶報告實驗也證實ETS1是miR-125b的直接靶基因。利用RNAi技術(shù)抑制ETS1的表達后同樣可觀察到細胞增殖的抑制、克隆數(shù)目減少以及細胞周期G1期增多,提示miR-125b可通過

6、下調(diào)ETS1實現(xiàn)其抑制增殖、克隆形成以及影響細胞周期進程的功能。這些結(jié)果說明miR—125b在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)一個重要的抑癌基因,可能為乳腺癌的治療策略帶來新的啟示。
　　 結(jié)論：
　　 miR-125b通過抑制ETS1的表達抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞周期G1增多,提示miR-125b在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用,可能在乳腺癌診斷、預(yù)后判斷以及治療中具有潛在的應(yīng)用價值。
　　 第二章 LATS2在鼻咽癌組織中

7、的表達及其細胞生物學(xué)功能研究
　　 研究背景及研究目的：
　　 LATS2編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶,在中心體復(fù)制和保持基因組穩(wěn)定性具有重要的意義。近來有報道LATS2參與腫瘤發(fā)生過程。在乳腺癌和急性淋巴細胞白血病中,LATS2 mRNA表達下調(diào)。然而,LATS2在鼻咽癌中的表達及功能研究目前還沒有報道,本研究以華南地區(qū)NPC人群為研究對象,分析LATS2的表達水平與鼻咽癌病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,并進一步深入探討LAT

8、S2表達調(diào)控機制和生物學(xué)功能。
　　 研究方法：
　　 應(yīng)用real-time PCR和免疫印跡的方法檢測鼻咽癌細胞株和鼻咽上皮永生化細胞NP69細胞中LATS2的表達水平,應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測220例鼻咽癌組織中LATS2蛋白的表達情況,并分析LATS2蛋白表達與病人臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,應(yīng)用甲基化特異性PCR,我們檢測LATS2基因啟動子甲基化狀態(tài),應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在鼻咽癌細胞株5-8F和CNE2中轉(zhuǎn)染s

9、iRNA抑制LATS2的表達。
　　 研究結(jié)果：
　　 在220個病例中,LATS2染色陽性的178例,陽性率80.91％(178/220),進一步分析顯示LATS2表達水平與NPC病人臨床病理特征無關(guān),與預(yù)后有關(guān),LATS2高表達的病人五年生存率(57.23％)顯著低于LATS2低表達的病人(73.96％),Cox多重回歸分析表明LATS2是鼻咽癌獨立預(yù)后指標(biāo)之一。甲基化特異性PCR檢測顯示30例鼻咽癌組織中11(36

10、.7％)例表現(xiàn)為LATS2啟動子甲基化,而23例鼻咽粘膜慢性炎組織均表現(xiàn)為LATS2啟動子甲基化(100％),提示鼻咽癌組織中LATS2高表達可能是由于其啟動子的去甲基化。進一步利用RNAi技術(shù)抑制LATS2表達,結(jié)果顯示抑制LATS2表達可抑制細胞增殖,誘導(dǎo)細胞凋亡以及細胞周期S期增多；在NP69細胞中過表達LATS2可促進細胞的增殖。
　　 結(jié)論：
　　 本研究的結(jié)果揭示了LATS2在促進細胞增殖以及鼻咽癌發(fā)生中的重