雄激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞免疫的機制研究.pdf

1、雄激素(Androgen)是體內(nèi)一類碳-19固醇物質(zhì)的總稱，包括睪酮(Testosterone，T)、雙氫睪酮(DihydrotestosteroneDHT)等。腦是雄激素作用的重要靶器官，雄激素不僅對腦的記憶與認知功能有一定的影響，還對神經(jīng)系統(tǒng)有保護調(diào)節(jié)作用。目前雄激素對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用的研究多以神經(jīng)元為研究對象。星形膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)元具有營養(yǎng)、保護、支持、調(diào)節(jié)等重要的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定和功能的正常

2、發(fā)揮有著重要的作用。研究雄激素對星形膠質(zhì)細胞的免疫調(diào)節(jié)機制，不僅為雄激素對神經(jīng)系統(tǒng)的保護調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)，還對一些神經(jīng)性疾病，尤其是與雄激素相關的一些老年性疾病的治療和預防有重要的理論價值。
　　為了更有效的研究雄激素對體外星形膠質(zhì)細胞的免疫學機制的作用，需要構建合理的星形膠質(zhì)細胞體外培養(yǎng)體系。本實驗的原代星形膠質(zhì)細胞取自1～3日齡的SD大鼠的新生鼠，然后經(jīng)過原代細胞的分離培養(yǎng)，并經(jīng)多次純化和傳代獲得所需細胞，所得細胞的純化率

3、達99％以上?？蔀轶w外研究提供符合要求的星形膠質(zhì)細胞。
　　本實驗通過采用10μg/ml的LPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，再分別用濃度為0nM、10nM、100nM的5α-DHT處理激發(fā)培養(yǎng)的AST24h。結果發(fā)現(xiàn)隨5α-DHT濃度增加細胞的活性下降，其中LPS+10nM5α-DHT組細胞活性較LPS+0nM5α-DHT組下降且差異顯著(P＜0.05)，而與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。當采用10μg/ml的LPS激發(fā)培養(yǎng)A

4、ST10h后，再用濃度為10nM的5α-DHT處理激發(fā)培養(yǎng)的AST24h后，分別檢測0h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h時星形膠質(zhì)細胞的活性，結果顯示24h時只加LPS組比LPS+5α-DHT組活性高14.03％，差異顯著（P＜0.05），其它組差異不顯著。
　　細胞的免疫功能與細胞周期有一定相關性，本實驗用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM、10nM5α-DHT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24

5、h后收集細胞進行細胞周期檢測。經(jīng)流式細胞技術檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)10nM5α-DHT能顯著抑制10μg/mlLPS誘導的S+G2期細胞比率的升高（P＜0.05）。
　　星形膠質(zhì)細胞發(fā)生炎癥反應時，會發(fā)生超微結構的改變，為了解雄激素對其超微結構的調(diào)節(jié)作用，本試驗采用10μg/mlLPS激發(fā)AST10h后，試驗組用10nM5α-DHT繼續(xù)處理24h，對照組加0nM5α-DHT處理，利用常規(guī)培養(yǎng)細胞電鏡制備技術制作電鏡標本。結果表明10μ

6、g/mlLPS使AST粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分線粒體腫脹，甚至空泡化，而LPS+10nM5α-DHT組異常的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體明顯減少。
　　為了了解雄激素對星形膠質(zhì)細胞免疫介質(zhì)分泌水平的影響，試驗用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM、10nM5α-DHT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后測定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。發(fā)現(xiàn)，隨著雄激素濃度升高，由LPS誘導的ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌水平

7、下降，其中10nM5α-DHT可以顯著抑制LPS誘導的NO、IL-1β和TNF-α的分泌（P＜0.05）。
　　為了進一步確定ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌水平下降是雄激素作用的結果，實驗用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，加入含濃度為0nM5α-DHT、10nM5α-DHT、10nM5α-DHT+100nM氟他胺的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后測定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。結果發(fā)現(xiàn)，加氟他胺組雄激素失

8、去對LPS的抑制作用。同時，檢測10μg/mlLPS+10nM5α-DHT組和10μg/mlLPS+10nM5α-DHT+100Nm氟他胺組0.5h、1h、2h、8h、12h、24h時ASTNO、IL-1β和TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)10μg/mlLPS+10nM5α-DHT組ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌逐漸下降，10μg/mlLPS+10nM5α-DHT+100Nm氟他胺組ASTNO、IL-1β和TNF-α的分泌逐漸升高。

9、>　　為了了解雄激素作用的信號轉導路徑，試驗用10μg/mlLPS激發(fā)培養(yǎng)AST10h后，添加10nM5α-DHT，在加5α-DHT前30min分別加20μMp38抑制物SB203580、20μMERK-1/-2抑制物U0126，對照組加0μMSB203580和U0126，繼續(xù)培養(yǎng)10min后測定ASTNO、IL-1β和TNF-α水平。結果發(fā)現(xiàn)雄激素可以通過ERK-1/-2轉導路徑調(diào)節(jié)AST免疫反應。檢測20μMSB203580和20μ

10、MU0126組5min、10min、20min、30min時ASTNO、IL-1β和TNF-α水平，結果顯示20μMSB203580組ASTNO和IL-1β水平變化不顯著，而TNF-α水平逐漸下降，20μMU0126組ASTNO、IL-1β和TNF-α水平均無顯著變化。
　　綜上所述，本試驗可以得到如下結論:
　　1、本試驗構建了雄激素調(diào)節(jié)AST功能的體外研究模型。
　　2、雄激素可以顯著抑制10μg/mlLPS引起的