骨髓瘤細胞誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞Cx43表達變化及其在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細胞在骨髓中異常增生的惡性腫瘤,這些異常增生的漿細胞與骨髓基質(zhì)細胞密切相關(guān)。MM細胞與骨髓微環(huán)境可通過直接接觸及分泌細胞因子的方式間接相互作用。在MM的發(fā)展過程中,骨髓微環(huán)境逐漸表現(xiàn)出支持 MM細胞生存和增殖的特征。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)參與構(gòu)建骨髓微環(huán)境,參與促進 MM細胞的生長及骨破壞的發(fā)生;同時,MM細胞對骨髓微環(huán)境重塑使其成為適合MM細胞生存和增殖場所。目前,此過程中涉及的具體機制尚未完全闡明。<

2、br>　　間隙連接是普遍存在的一種細胞間連接方式,相鄰細胞間通過間隙連接介導的細胞間隙連接通訊(GJIC)進行著信息和能量物質(zhì)的交換,對細胞增殖、分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用。間隙連接蛋白43(Cx43)是在人體表達最高的一種間隙連接物質(zhì),可在包括造血干細胞、基質(zhì)細胞等多種細胞表達,參與造血調(diào)控。Cx43表達及功能異常在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。那么在MM的發(fā)生、發(fā)展中, MM細胞及BMSCs如何相互作用,是否發(fā)生間隙連接

3、的表達或功能改變,其改變又有怎樣的生物學效應(yīng)?我們通過建立 MM細胞與 BMSCs的共培養(yǎng)體系,研究 MM細胞對BMSCs Cx43表達及功能的影響以及此過程中MM細胞及BMSCs的生物學行為的變化,從而進一步探討MM的發(fā)病機制。
　　本課題為國家自然科學基金項目(NO81071934/H1616)“接頭蛋白Cx43在多發(fā)性骨髓瘤成骨細胞巢重塑中的作用”的重要研究內(nèi)容,該實驗完成為此項目的結(jié)題、文章發(fā)表及延伸課題的申報奠定基礎(chǔ)。本

4、文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 Cx43在骨髓瘤細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的表達及生物學功能
　　目的:檢測人MM細胞及BMSCs的Cx43表達,探討間隙連接在BMSCs誘導的MM細胞的遷移、粘附中的作用及其對BMSCs的基質(zhì)細胞衍生因子-1α(SDF-1α)分泌的影響。
　　方法:貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人BMSCs,CD138磁珠及midi MACs分選原代MM細胞,流式細胞儀測定BMSCs及原代MM細胞的免疫表型

5、。Westernblot及免疫熒光檢測Cx43在BMSCs的表達。CCK-8法檢測間隙連接阻斷劑18α-甘草次酸(18α-GA)對MM細胞及BMSCs增殖的作用;微孔隔離實驗檢測18α-GA對BMSCs誘導的MM細胞遷移、粘附能力的影響。ELISA檢測BMSCs SDF-1α分泌水平。
　　結(jié)果:1)MM細胞系RPMI8226、U266及1例原代MM細胞中、低度表達Cx43,XG-4、XG-7細胞不表達Cx43。BMSCs高表達C

6、x43。初診 MM患者的BMSCs(MM-MSC)Cx43表達高于正常供者的BMSCs(ND-MSC)。2)18α-GA對RPMI8226細胞和BMSCs的增殖無明顯影響。3)18α-GA抑制BMSCs的SDF-1α分泌,其作用前后SDF-1α濃度分別為(237.84±9.23)pg/ml、(94.31±6.44)pg/ml(P<0.01)。4)18α-GA可抑制BMSCs誘導的MM細胞遷移,BMSCs經(jīng)其作用前后RPMI8226細胞遷

7、移率分別為(8.0±0.673)％及(4.82±0.186)％(P<0.01),XG-7的細胞遷移率分別為(0.88±0.036)％、(0.58±0.020)％(P<0.05)。5)18α-GA可抑制MM細胞在BMSCs的粘附,其作用前后 RPMI8226細胞粘附率分別為(16.967±1.55)％、(11.1±0.819)％(P<0.05),XG-7的細胞粘附率分別為(9.5±1.323)％、(6.63±0.551)％(P<0.05)

8、。
　　結(jié)論:BMSCs及部分MM細胞表達Cx43, MM-MSC Cx43表達高于ND-MSC。阻斷間隙連接可抑制 BMSCs誘導的MM細胞的遷移和粘附,并可抑制BMSCs的SDF-1α分泌。
　　第二部分 三維BMSCs細胞球的建立及其特點觀察
　　目的:建立BMSCs的三維培養(yǎng)方法以模擬骨髓微環(huán)境,并觀察MM細胞在三維培養(yǎng)的BMSCs細胞球中的遷移。
　　方法:在瓊脂糖包被的圓底培養(yǎng)板中進行BMSCs的三維

9、培養(yǎng),倒置顯微鏡、HE染色及電鏡下觀察三維培養(yǎng)的BMSCs(3D-BMSCs)的形態(tài)特點,RT-PCR檢測3D-BMSCs和普通二維培養(yǎng)的BMSCs(2D-BMSCs)的Cx43 mRNA、SDF-1αmRNA的表達。免疫熒光檢測18α-GA對RPMI8226細胞在3D-BMSCs細胞球中遷移的影響。
　　結(jié)果:BMSCs在瓊脂糖包被的圓底培養(yǎng)板中可呈球形生長,4天后細胞球直徑約450μm。細胞球石蠟切片HE染色示,細胞球外層多為

10、長梭形細胞,內(nèi)部為多角形、不規(guī)則細胞。掃描電鏡示,BMSCs細胞及其胞外絲狀突起、基質(zhì)樣物質(zhì)形成細胞球的外層結(jié)構(gòu),外層BMSCs仍為長梭形。與2D-BMSCs相比,3D-BMSCs的SDF-1αmRNA表達明顯升高,Cx43 mRNA表達無明顯差別;18α-GA可抑制RPMI8226細胞在3D-BMSCs細胞球中的遷移。
　　結(jié)論:3D-BMSCs細胞球在一定程度上可模擬骨髓微環(huán)境,其SDF-1αmRNA表達較2D-BMSCs明顯

11、升高,并且其Cx43表達對誘導MM細胞的遷移有重要作用。
　　第三部分 MM細胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中Cx43表達變化及其生物學效應(yīng)
　　目的:觀察MM細胞與BMSCs共培養(yǎng)體系中Cx43表達水平的變化及其對MM細胞及BMSCs生物學行為的影響。
　　方法:建立RPMI8226細胞和BMSCs的間接及直接共培養(yǎng)體系,用CD138磁珠分離直接共培養(yǎng)的RPMI8226細胞及BMSCs。實時定量PCR、Western bl

12、ot檢測共培養(yǎng)前后BMSCs的Cx43表達,免疫熒光法檢測Cx43分布;劃痕實驗檢測共培養(yǎng)后BMSCs間隙連接通訊(GJIC)的變化;ELISA檢測共培養(yǎng)前后BMSCsSDF-1α分泌水平變化。Western blot檢測共培養(yǎng)前后BMSCs的beclin、LAMP、LC3表達及自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對共培養(yǎng)體系中BMSCs LC3及Cx43表達的影響。Vonkossa染色檢測RPMI8226細胞和3-MA對BMSCs成骨

13、分化的影響。
　　結(jié)果:1)直接或間接共培養(yǎng)后BMSCs的Cx43mRNA相對表達量明顯提高,分別是單獨培養(yǎng)時的1.36倍和2.1倍。2)Western blot檢測示共培養(yǎng)后BMSCs Cx43蛋白表達水平也上調(diào),免疫熒光示增高的Cx43主要分布在胞質(zhì)。3)劃痕實驗顯示在BMSCs與RPMI8226直接共培養(yǎng)后熒光染料在細胞間擴散距離增加。4)與BMSCs直接共培養(yǎng)后,RPMI8226細胞Cx43表達降低,間接共培養(yǎng)后Cx43表

14、達無明顯變化。5)在BMSCs與RPMI8226細胞直接和間接共培養(yǎng)體系中,BMSCs培養(yǎng)上清SDF-1α水平分別為(373.02±10.11)和(309.71±10.71)pg/ml,均高于共培養(yǎng)前(237.84±9.23)pg/ml(P<0.01,P<0.05)。經(jīng)18α-GA作用后,直接和間接共培養(yǎng)體系中SDF-1α分別降為(126.01±4.80)(P<0.001)和(106.99±3.39)pg/ml(P<0.01)。6)RP

15、MI8226與BMSCs共培養(yǎng)48h后,BMSCs的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、beclin均較對照組升高,溶酶體相關(guān)蛋白LAMP1也升高。3-MA抑制共培養(yǎng)體系中BMSCs的自噬水平,同時BMSCs的Cx43水平較前升高。RPMI8226細胞可抑制BMSCs的成骨分化,3-MA可減輕該抑制作用。
　　結(jié)論:MM細胞可通過上調(diào)BMSCs Cx43的表達并增強BMSCs的GJIC,從而促進BMSCs SDF-1α的分泌。MM細胞可通過上