異種抗原瘤內(nèi)注射對(duì)荷瘤小鼠S180肉瘤抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 腫瘤,作為一種嚴(yán)重影響人群健康的慢性疾病,發(fā)病率和死亡率逐年上升。在發(fā)展中的中國(guó),日益增長(zhǎng)的發(fā)病人數(shù)及治療費(fèi)用,已經(jīng)成為制約社會(huì)進(jìn)步和發(fā)展的絆腳石。腫瘤治療經(jīng)歷了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療,到分子靶向治療,似乎人類對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)還非常有限,盡管目前已經(jīng)公認(rèn)腫瘤是一種全身系統(tǒng)性的疾病,腫瘤學(xué)家也試圖通過(guò)系統(tǒng)地綜合治療,但目前尚未取得理想的效果。
　　 顯然,傳統(tǒng)的治療手段不足以消滅腫瘤,我們能否從腫瘤的生物學(xué)行

2、為中尋找新的方法呢?腫瘤學(xué)家正試圖通過(guò)干預(yù)腫瘤免疫來(lái)尋找答案,免疫治療應(yīng)用于腫瘤治療,并成為目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)之一。腫瘤免疫治療的目的是激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力,從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。腫瘤免疫學(xué)治療的方法種類繁多,已與現(xiàn)代生物高科技結(jié)合,發(fā)展成為繼手術(shù)、化療和放療之后的第四種腫瘤治療模式。免疫增強(qiáng)劑是一類具有廣泛生物學(xué)活性和抗腫瘤活性的生物制劑,既包括一大類天然產(chǎn)生的生物物質(zhì),又包括能改變體內(nèi)宿主和腫瘤平衡

3、狀態(tài)的方法和手段,被廣泛用于抗腫瘤治療。雖然作用機(jī)制多種多樣,但不外乎兩大方面:通過(guò)干擾細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)移的直接抗瘤作用或通過(guò)激活免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)特異性免疫,達(dá)到對(duì)腫瘤殺傷或抑制的目的。在臨床治療中已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。Okamoto H等最早用鏈球菌制備出抗腫瘤制劑OK-432。該制劑不僅具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,亦能增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能,如:激活NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng),已應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。越

4、來(lái)越多的研究表明在實(shí)體腫瘤和血液惡性腫瘤患者中外周血和腫瘤局部微環(huán)境中Treg數(shù)目增多,比例增高,且數(shù)目與患者腫瘤進(jìn)展程度、預(yù)后和生存率呈負(fù)相關(guān)。本中心前期實(shí)驗(yàn)表明采取太空滅活鏈球菌免疫序貫瘤內(nèi)注射的治療方法發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)滅活鏈球菌免疫后小鼠的效應(yīng)細(xì)胞更快地被募集,腫瘤MHC-Ⅰ類抗原上調(diào),減少了腫痛局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量,可以有效地在改善腫瘤局部免疫狀況,有良好的抗腫瘤作用。序貫療法目前尚無(wú)明確的定義,藥物的序貫療法通常是指連續(xù)用藥達(dá)到藥

5、物穩(wěn)定的抗腫瘤血藥濃度后改用口服制劑或暫停用藥,以維持有效藥物在血漿中的濃度。序貫療法可縮短住院時(shí)間,降低治療費(fèi)用,特別對(duì)于需要長(zhǎng)期維持給藥的患者,可以預(yù)防長(zhǎng)期靜脈輸液引起的感染,減少藥物副作用所致的死亡,是值得臨床推廣的一種治療方法。針對(duì)免疫制劑長(zhǎng)期應(yīng)用,本研究在前人實(shí)驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)使用太空滅活鏈球菌作為異種抗原來(lái)探索不同的瘤內(nèi)給藥模式對(duì)小鼠S180腫瘤的抗腫瘤作用,荷瘤小鼠對(duì)太空滅活鏈球菌治療的耐受性以及重要器官病理學(xué)改變,重

6、點(diǎn)分析太空滅活鏈球菌瘤內(nèi)注射后對(duì)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的影響。
　　 目的：
　　 研究太空滅活鏈球菌瘤內(nèi)注射對(duì)S180荷瘤小鼠抗腫瘤療效、荷瘤小鼠腫瘤組織內(nèi)凋亡相關(guān)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)的影響以及長(zhǎng)期用藥后對(duì)肝臟和腎臟毒性作用的初步探索。
　　 方法
　　 1.S180實(shí)體瘤小鼠模型構(gòu)建 4-6周齡雌性昆明小鼠40只,獲贈(zèng)S180腹水小鼠,觀察后五日后無(wú)菌抽取腹水,培養(yǎng)3-4代后細(xì)胞生長(zhǎng)

7、旺盛,制成癌細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,取0.1ml用于小鼠背部皮下接種以制作實(shí)體瘤模型,成瘤率近100％。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:造模成功后第8天按大小均一性原則選取30只分成三組,每組10只:A、太空滅活鏈球菌連續(xù)瘤內(nèi)注射組；B、太空滅活鏈球菌序貫組瘤內(nèi)注射組；C、生理鹽水瘤內(nèi)注射空白對(duì)照組。
　　 3.瘤內(nèi)注射藥物及安慰劑 按照分組開(kāi)始進(jìn)行瘤內(nèi)注射(A組小鼠連續(xù)每天瘤內(nèi)注射濃度為1mg/ml的太空

8、滅活鏈球菌0.1ml/只；B組小鼠連續(xù)5天瘤內(nèi)注射濃度為1mg/ml的太空滅活鏈球菌0.1ml/只,然后休息2天,C組瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1ml/只)。研究以荷瘤小鼠的死亡為觀察終點(diǎn)。所有瘤內(nèi)注射均嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,采取多點(diǎn)注射。
　　 4.觀察和測(cè)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 注射后每周測(cè)量腫瘤大小,計(jì)算腫瘤體積,腫瘤體積按公式:長(zhǎng)徑×寬徑×寬徑/2。記錄各組小鼠治療后生存時(shí)間。
　　 5.免疫組織化學(xué)技術(shù)測(cè)腫瘤組織Bcl-2、Bax蛋

9、白表達(dá)
　　 6.圖片的數(shù)字化處理 每組免疫組化染色切片按隨機(jī)原則選取5個(gè)不同顯色部位,NIKON TE顯微鏡×400下拍照,保存圖片資料,使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行染色光密度分析。
　　 7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)使用(x)±s表示,腫瘤體積使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析,生存期使用Kaplan-Meier法分析,免疫組化圖片積分光密度使用單因素方差分析。
　　 8.獲取荷

10、瘤小鼠肝臟和腎臟標(biāo)本,經(jīng)HE染色觀察組織病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果
　　 1.小鼠S180腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)后生長(zhǎng)旺盛,接種皮下成瘤率高。
　　 2.連續(xù)注射組和序貫注射組用藥后每周的腫瘤平均體積均呈下降趨勢(shì),與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。連續(xù)注射組和序貫注射組之間差異不明顯(P=0.81),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.各組小鼠生長(zhǎng)曲線表明,連續(xù)注射組、序貫注射組和對(duì)照組荷瘤小鼠治療后中位生存時(shí)間分

11、別為38.0天、37.0天、34.0天。連續(xù)組與序貫組比較,P>0.05,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連續(xù)組與塒照組比較,P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；序貫組與對(duì)照組比較,P<0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4.瘤內(nèi)注射太空滅活鏈球菌組與對(duì)照組比較,太空滅活鏈球藺瘤內(nèi)注射組的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減低,Bax蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。
　　 5.太空滅活鏈球菌作為異種抗原瘤內(nèi)注射主要作用于腫瘤局部,