Stat5徑路調(diào)控膽鹽轉運子Ntcp和Bsep表達及促膽鹽轉運的實驗研究.pdf

1、研究背景： 膽酸(鹽)是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機酸，是膽汁的主要成分。梗阻性黃疸(obstructivejaundice，OJ)時高膽酸(鹽)血癥會引發(fā)腸道細菌移位和內(nèi)毒素血癥，后者又可進一步誘導機體免疫功能障礙、胃腸道黏膜損傷、凝血機制紊亂甚至急性腎功能衰竭，從而形成惡性循環(huán)，病死率亦居高不下。臨床上亦有部分重度OJ患者即使在膽道梗阻解除后黃疸消退仍緩慢甚或發(fā)生嚴重并發(fā)癥。因此深入研究膽道梗阻及再通后病理生理改變的分子機制

2、，對臨床如何增強長期重度OJ患者的手術耐受性、提高手術安全性、促進術后的恢復具有重要意義。 近年來，具有肝組織特異性的膽鹽轉運子越來越受到人們的關注。鈉-牛磺膽酸鹽共轉運多肽(Na+-taurocholatecotransportingpolypeptide，Ntcp)和膽鹽輸出泵(bilesaltexportpump，Bsep)是分別位于肝細胞膜血竇面和毛細膽管面上介導膽酸(鹽)依賴ATP進行代謝的膜糖蛋白，兩者的表達和/或功

3、能異常是導致各種膽汁淤積癥的根本因素。我們曾研究證實重組人生長激素(recombinanthumangrowthhormone，rhGH)能明顯促進大鼠肝細胞對膽紅素的代謝，但其對膽鹽轉運的影響如何尚不清楚。 生長激素與生長激素受體(growthhormonereceptor，GHR)結合引起信號轉導與轉錄活化因子5(signaltransducerandactivatoroftranscription5，STAT5)徑路活化是

4、GH發(fā)揮效應的最主要途徑。肝臟是人體內(nèi)GHR含量最多的器官，既往在對OJ大鼠肝再生與GH/GHR軸關系的研究中發(fā)現(xiàn)，OJ大鼠存在GH分泌不足和GHR表達下降，相應的Stat5活性下調(diào)。我們推測，外源性補充rhGH能通過上調(diào)肝細胞胞漿內(nèi)Stat5活性，后者移位至細胞核內(nèi)與靶序列結合，進而調(diào)控Ntcp和Bsep基因表達，起到促進膽鹽代謝的效應。 目的： 本研究擬通過建立膽道梗阻-再通大鼠模型，觀察Ntcp和Bsep在膽道梗阻

5、.再通大鼠肝組織中的表達變化，以及rhGH對Ntcp和Bsep表達的影響，結合肝組織Stat5表達水平及功能活性，探討GH/GHR-Stat5徑路調(diào)控膽酸(鹽)代謝的分子機制，為臨床上防治梗阻性黃疸及其嚴重并發(fā)癥、促進術后恢復提供新的思路。 方法與結果： 1、重組人生長激素在膽道梗阻-再通大鼠中的應用價值：大鼠被隨機分為A組(假手術組)、B組(膽道梗阻-再通-NaCl注射組)及C組(膽道梗阻-再通-rhGH注射組)，B組

6、術后14d大鼠累積病死率為41.9％(13/31)，與C組14.3％(3/21)相比，差異具有統(tǒng)計學意義(x2=4.493，P=0.034)。給予rhGH的c組大鼠血清學各項指標(ALT、TBIL、TBA和TNF-α)的改善明顯優(yōu)于0.9％NaCl注射的B組，隨用藥天數(shù)的增加，效果更趨明顯，特別是在Pst14d時ALT和TNF-α水平已回落至A組水平，并顯著低于B組(P＜0.05)。應用透射電鏡觀察肝組織超微結構改變，結果顯示C組肝細胞

7、線粒體腫脹、毛細膽管擴張以及單位面積微絨毛數(shù)量減少均較B組減輕，至Pst14d時肝細胞及毛細膽管形態(tài)恢復較好，微絨毛數(shù)量明顯增加。 2、膽鹽轉運子Ntcp和Bsep在膽道梗阻-再通大鼠中的表達和意義：采用免疫組織化學、逆轉錄PCR及Westernblotting等技術分別在肝細胞膜上定位、基因轉錄及蛋白翻譯等水平上檢測Ntcp和Bsep的表達情況以及rhGH對Ntcp和Bsep表達的影響。結果顯示：CBDL術后Ntcp與：Bse

8、pmRNA及蛋白表達即明顯減弱(P＜0.05)，Pst7d降至最低，BDR術后兩者的表達緩慢增加，至Pst14d時仍未恢復至A組水平(P＜0.05)。各時相點下C組大鼠肝組織中兩種轉運子的表達水平高于B組。 3、rhGH活化Stat5徑路對膽鹽轉運子Ntcp和Bsep的調(diào)控機制研究：采用肝組織切片原位雜交(insituhybridization，ISH)和電泳遷移率變動分析(electrophoreticmobilityshif

9、tassay,EMSA)檢測stat5mRNA表達水平以及Stat5與靶序列的結合能力，從不同層面探討Stat5表達以及功能活性變化的規(guī)律。結果顯示：膽道梗阻在很大程度上抑制了Stat5的表達和功能，在該模型中Stat5的轉錄水平以及與靶序列結合活性同樣呈現(xiàn)出先下降再緩慢上升的變化趨勢，rhGH能部分維護Stat5徑路的功能活性。 結論： 1、rhGH的應用能增強OJ大鼠進行膽道再通手術的耐受性、提高安全性，并促進術后的

10、恢復，具有“利膽”和改善肝功能的有益效應； 2、膽道梗阻時Ntcp和Bsep表達均明顯下調(diào)，膽道再通后緩慢恢復，尤其是Bsep恢復得更為緩慢，這可能是重度OJ患者術后血清膽鹽水平下降遲緩、恢復不容樂觀的主要原因之一； 3、rhGH能通過上調(diào)Ntcp和Bsep表達，增加肝細胞對膽鹽的攝取和排泌，促進膽道再通后膽鹽轉運系統(tǒng)功能的恢復； 4、膽道梗阻抑制了Stat5的表達和功能，與梗阻期間GH/GHR軸活性下調(diào)有關，并