血管緊張素(1-7)對(duì)大鼠腎小球硬化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分血管緊張素(1-7)對(duì)5/6腎切除大鼠的保護(hù)作用
　　目的:
　　ACE2-血管緊張素(1-7)-Mas軸具有對(duì)抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)，抗增生和抗纖維化特性。本研究擬觀察血管緊張素(1-7)單獨(dú)或聯(lián)合ARB藥物對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟的保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.雄性SD大鼠行Sham和5/6腎切除手術(shù)。分組:假手術(shù)組（Sham組，n=6）、5/6腎切除組（Nx組，n=6）、血管緊張素(1-7)治療組(

2、Ang(1-7)組，24μg/kg/h，皮下微泵埋置，n=6）、Ang(1-7)+氯沙坦治療組（A+L組，n=6）和氯沙坦治療組（Losartan組，10mg/kg/d灌胄，n=6）。8周后測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓及收集24小時(shí)尿液檢測(cè)尿蛋白，檢測(cè)Scr水平和RIA法檢測(cè)血漿AngⅡ和Ang(1-7)含量。
　　2.PAS染色觀察腎臟病理變化;免疫組化檢測(cè)腎小球硬化指標(biāo)Fibronectin(FN)和CollagenⅠ(ColⅠ)的表達(dá);

3、DCFDA法檢測(cè)腎組織ROS產(chǎn)物的表達(dá)。
　　3.Real-time PCR檢測(cè) Mas受體和PAI-1 mRNA水平;Western blot法檢測(cè)腎組織FN、血管生成素(Ang)-Tie-2以及p47-phox和p67-phox的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　Ang(1-7)組、Losartan組和A+L組均可改善Nx組大鼠尿蛋白、血肌酊水平，升高血漿Ang(1-7)含量，減輕腎小球的硬化程度，降低腎小球硬化指標(biāo)(F

4、N、PAI-1和 ColⅠ)和ROS表達(dá)以及NADPH氧化酶（p47-phox和p67-phox）活性。Ang(1-7)組改善尿蛋白、血肌酐、硬化指標(biāo)作用弱于A+L組和Losartan組，對(duì)血壓、Ang-1/Ang-2比值無影響。Losartan組顯著升高血漿AngⅡ水平，對(duì)Ang-1/Ang-2比值無影響。A+L組改善5/6腎切除大鼠腎損傷較Ang(1-7)組和Losartan組更顯著。
　　結(jié)論:
　　Ang(1-7)具

5、有拮抗AngⅡ的作用而改善5/6腎切除大鼠腎損傷，Ang(1-7)和氯沙坦雙向阻斷AngⅡ的作用，對(duì)延緩慢性腎臟疾病的進(jìn)展有更好的保護(hù)作用。
　　第二部分Ang(1-7)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)系膜細(xì)胞纖連蛋白表達(dá)的影響
　　目的:
　　Ang(1-7)在腎小球固有細(xì)胞如系膜細(xì)胞中抗纖維化作用尚不明確。本研究擬觀察Ang(1-7)對(duì)抗AngⅡ誘導(dǎo)系膜細(xì)胞FN的表達(dá)及其具體機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)

6、胞，應(yīng)用Western blot方法觀察Ang(1-7)處理AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞后FN表達(dá)情況以及Losartan阻斷AT1同時(shí)給予Ang(1-7)后FN表達(dá)情況。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50％時(shí)，向6孔板中分別轉(zhuǎn)入500nM Mas特異性干擾RNA(Mas siRNA)和空載對(duì)照干擾RNA(VehiclesiRNA)，處理24小時(shí)后，根據(jù)不同分組，分別向6孔板中加入Ang(1-7)、AngⅡ和 DX-600，應(yīng)

7、用Western blot和Real-time PCR方法檢測(cè) FN的表達(dá)的情況。
　　3.體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞，應(yīng)用免疫共沉淀法觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染Vehicle siRNA和Mas siRNA后，AT1和Mas的表達(dá)情況以及兩者相互關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.Ang(1-7)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)系膜細(xì)胞FN蛋白表達(dá)增多無影響。
　　2.Mas siRNA干擾Mas表達(dá)或給予DX-600減少Ang(1-7)的生成均可明顯增加

8、AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞FN的表達(dá)(P＜0.05)。
　　3.在無外源性AngⅡ的情況下，Ang(1-7)本身較對(duì)照組FN表達(dá)無差異，而阻斷AT1后，Ang(1-7)顯著減少FN的表達(dá)(P＜0.05)。
　　4.AT1與Mas之間可形成復(fù)合物的中間狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　在無外源性AngⅡ的情況下，Ang(1-7)拮抗AngⅡ誘導(dǎo)FN表達(dá)，而Ang(1-7)對(duì)外源性AngⅡ誘導(dǎo)系膜細(xì)胞FN表達(dá)增多無影響，可能與兩者受體之

9、間形成AT1-Mas復(fù)合物中間狀態(tài)的解離有關(guān)。
　　第三部分Ang(1-7)對(duì)腎小球血管生成素-Tie-2系統(tǒng)的影響及機(jī)制研究
　　目的:
　　血管生成素-Tie-2系統(tǒng)為腎小球固有細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞，足細(xì)胞）特有的血管生成系統(tǒng)之一。Ang(1-7)具有抑制血管生成的作用，而此效應(yīng)在腎小球細(xì)胞中未見報(bào)道。本研究擬觀察Ang(1-7)對(duì)腎小球血管生成素-Tie-2系統(tǒng)的影響及其可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.體外

10、培養(yǎng)小鼠腎內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用Matrigel凝膠法觀察內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成能力。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用Real-time PCR法檢測(cè)不同劑量Ang(1-7)或AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞表達(dá)Ang-1和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Ang-2的影響。
　　3.體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，在無或有外源性AngⅡ的情況下，根據(jù)不同分組，分別給予Ang(1-7)、Losartan、Mas受體阻斷劑A-779和ERK1/2阻斷劑PD98059，

11、運(yùn)用Western blot法檢測(cè)Ang-1、Ang-2及受體Tie-2表達(dá)以及eNOS磷酸化、ERK1/2磷酸化水平。
　　結(jié)果:
　　1.在無外源性AngⅡ條件下，Losartan能協(xié)同Ang(1-7)抑制血管生成素-Tie-2的表達(dá)。在有外源性AngⅡ條件下，Ang(1-7)抑制血管生成素-Tie-2的表達(dá)更顯著(P＜0.05)，Losartan、A-779和PD98059能逆轉(zhuǎn)Ang(1-7)對(duì)血管生成素-Tie-2

12、的表達(dá)的抑制作用(P＜0.05）。
　　2.Ang(1-7)本身激活eNOS信號(hào)通路（P＜0.05）;在有外源性AngⅡ條件下，Ang(1-7)致內(nèi)皮細(xì)胞eNOS磷酸化顯著減少，ERK1/2磷酸化明顯增加，而給予NO合成酶抑制劑L-NAME，增加的ERK1/2磷酸化受到明顯抑制(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　Ang(1-7)本身抑制血管生成，對(duì)抗內(nèi)源性AngⅡ促生長(zhǎng)作用;Ang(1-7)與外源性AngⅡ共同作用，通