小鼠體內Perlecan∕VEGF-165促進血管生成的實驗研究.pdf

1、血管生成在組織損傷修復的過程中起著非常重要的作用。新生血管為細胞增殖和組織修復提供營養(yǎng)和氧離子。血管的生長分化是一個動態(tài)化的復雜過程，時間和空間上受多種信號分子、細胞外基質、間充質細胞的嚴格調控。近來的研究發(fā)現內皮細胞參與血管生成，并且內皮細胞在血管生成過程起著十分重要的作用。內皮細胞上各因子的表達升高或降低可以促進或抑制血管生成。內皮細胞成分復雜，其中Perlecan和VEGF-165是與血管生成關系密切的主要成分。
　　Per

2、lecan是基底膜上和細胞間質中最主要的基底膜蛋白多糖，是一種大分子多結構域的細胞外基底膜蛋白多糖，是脊椎動物最大的單鏈多肽分子之一。Perlecan的蛋白核心結構分為五個區(qū)域，這五個區(qū)域分別與相應物質的形成有關，還可以在組織生長、重塑、腫瘤生長過程中改變多肽鏈的形態(tài)從而最大化的發(fā)揮各自的作用。Perlecan存在于大部分的細胞外基質（ECM）和基底膜上，參與調節(jié)血管生成，具有儲存、保護、加強血管生長因子的功能，在調節(jié)血管生物學行為和組

3、織損傷修復過程中具有很重要的作用。Perlecan參與血管生成過程，新形成的血管周圍可以檢測到Perlecan的高水平表達。
　　血管內皮生長因子（VEGF-165）是最先發(fā)現的血管內皮生長因子，被認為是血管生長因子家族最典型的代表，它的主要特征是對血管內皮細胞起調控作用，廣泛存在于血管內皮。VEGF-165的發(fā)現改變了血管生成領域的研究，能直接誘導血管內皮生長，同時VEGF-165還可以和基底膜蛋白多糖的硫酸乙酰肝素鏈結合促進血

4、管生成。
　　聚乳酸(polylactic acid，PLA)是目前最常采用的構建組織工程血管的支架材料。OPLA支架是由D，D-L，L聚乳酸形成的復合支架，復合支架本身的三維多孔結構和連通性有利于細胞的粘附、遷移、增殖，具有優(yōu)良的可降解性，可塑性，良好的生物相容性，有利于營養(yǎng)物質的傳遞和支架的血管化，因此我們采用這種支架和Perlecan、VEGF-165相結合的方法，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，在體研究促進血管生成效果。
　　本課題

5、將提純的Perlecan和VEGF-165植入小鼠體內，促進局部血管生成，具有仿生性，可以模擬自身血管生成過程。本實驗的目的在于觀察重組生物材料在具有正常排異反應的小鼠體內的生物相容性，并分別定性、定量分析復合支架的促血管生成情況，這樣不僅可以改進現有生物材料和組織工程支架的性能，還很有可能成為一種治療血管損傷、促進血管改型的有效手段，為臨床應用進一步提供準確的理論參數。基于此，本研究將致力于研究復合支架的促血管生成性能，使該重組復合材

6、料具有更深遠更廣泛的實用價值。
　　吳丹已經證實Perlecan的制備和純化過程的可靠性以及Perlecan與VEGF-165結合的穩(wěn)定性和特異性，本實驗鑒于之前的研究成果進一步進行，研究內容如下：
　　1.小鼠體內重組材料促血管生成的定性分析
　　采用由D，D-L，L聚乳酸形成的復合支架OPLA，OPLA具有多孔小平面結構，有利于各種因子的吸附。支架分為無處理組和處理組，處理組為：表面吸附 VEGF-165的聚乳酸復

7、合支架、表面吸附有Perlecan的聚乳酸復合支架、表面吸附有Perlecan+ VEGF-165的聚乳酸復合支架；無處理組為OPLA支架。復合支架植入小鼠體內，在特定時間點取出植入材料，HE染色，觀察促血管生成情況，定性分析重組支架的促血管生成效果。我們發(fā)現：隨時間延長OPLA支架逐漸降解，與周圍組織有良好的生物相容性，復合支架內部血管長入逐漸增多，管徑增大，管壁增厚，血管逐漸成熟，血管伴隨組織逐漸深入支架內部；支架吸收嚴重。各組都可

8、觀察到血管生成，從HE染色切片上可觀察到處理組的血管生成較多，尤其是OPLA+Perlecan+VEGF-165組最多。
　　2.小鼠體內重組材料促血管生成的定量分析
　　通過血管生成的定量分析，發(fā)現對照組在整個實驗過程中微血管密度（MVD）增長最緩慢。OPLA+VEGF-165組在1周時與對照組差異不明顯，2周時增速迅速增大，MVD幾乎是對照組的兩倍，與OPLA+Perlecan組沒有明顯統(tǒng)計學差異；但第3周時，OPLA+

9、VEGF-165組MVD與對照組已無顯著性差異，與 OPLA+Perlecan組、OPLA+VEGF-165+Perlecan組差異具有統(tǒng)計學意義，血管生成速度明顯減慢；4周、6周、8周時OPLA+VEGF-165組MVD與OPLA+Perlecan組、OPLA+Perlecan+VEGF-165組差異具有統(tǒng)計學意義，說明VEGF-165在2周時釋放較快,促血管生成作用在2周時達到高峰。OPLA+Perlecan組與OPLA+Perle

10、can+VEGF-165組在1周時MVD差異不明顯，2周差異有統(tǒng)計學意義，3周時差異變小，但明顯高于對照組，說明雖然 Perlecan可以很好的促進血管生成，結合了VEGF-165的Perlecan促血管發(fā)生作用更強，同時從另一個側面說明了VEGF-165在2周時釋放較快。OPLA+Perlecan+VEGF-165組的MVD均高于OPLA+Perlecan組，1周時，兩組間差異無統(tǒng)計學意義；2周時前者MVD明顯高于后者，推測是因為此時