丹參聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對兔急性心肌梗死后膠原重構及心功能的影響.pdf

1、一、兔骨髓間充質細胞的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定及標記
　　 目的：探討體外培養(yǎng)兔骨髓間充質干細胞（MSCs）的方法，為進一步的實驗研究打下基礎。
　　 材料與方法：選擇健康日本大耳白兔，取雙側脛骨行骨髓穿刺，提取動物骨髓，采用密度梯度離心法分離提取MSCs，通過貼壁培養(yǎng)篩選、純化獲得的MSCs，傳代培養(yǎng)。對MSCs進行形態(tài)學觀察，通過流式細胞儀，對CD34、CD29二種表面抗原進行鑒定，證明所培養(yǎng)的細胞為MSCs。傳代至第

2、3代時，加BrdU抗原，免疫組化方法檢測Brdu標記率。
　　 結果：分離培養(yǎng)48h，貼壁生長的原代MSCs數量少，呈長梭形，8d-10d細胞集落擴大，形態(tài)呈較均一的長梭形或三角形。達80％融合時消化傳代，傳代細胞生長旺盛時呈旋渦樣。培養(yǎng)的細胞經流式細胞儀鑒定，CD34（-）、CD29（+），證明所培養(yǎng)的細胞為較純的MSCs。MSCs經Brdu孵育后， BrdU體外標記率可達80％。
　　 結論：應用本實驗方法，可以分離

3、、純化培養(yǎng)兔MSCs，所培養(yǎng)的MSCs體外生長穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高、可連續(xù)傳代，可用于MSCs移植治療心肌梗死的進一步研究。
　　 二、丹參聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對兔急性心肌梗死后心室膠原基質重構的影響
　　 目的：觀察丹參聯(lián)合骨髓間充質干細胞（MSCs）移植對急性心肌梗死模型兔膠原容積和Ⅰ、Ⅲ型膠原比值的影響，探討兩者是否具有協(xié)同治療作用。
　　 方法：取日本大耳白兔2只，穿脛骨骨髓，應用貼壁和密度梯度

4、離心法分離、培養(yǎng)MSC，傳至第3代，行BrdU標記。10只兔作為正常對照組，另60只建立急性心肌梗死模型，造模成功后隨機均分為4組：模型組、丹參組、MSC組、丹參+MSC組。MSC組、丹參+MSC組于造模成功后7d靜脈注射MSC2×106；丹參組、丹參+MSC聯(lián)合組于造模成功后靜脈注射丹參15.4mg/kg，1次/d，共10d。各組于術后35d光鏡、電鏡觀察心肌組織病理改變；Masson染色及免疫組化測定膠原容積分數（CVF）、Ⅰ、Ⅲ型

5、膠原比值；夾心酶聯(lián)免疫（ELASA）法檢測血清MMP-1、TIMP-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。
　　 結果：MSC移植后35dMSC組、聯(lián)合組在梗死及周邊區(qū)存在Brdu顆粒。光鏡下模型組的梗死區(qū)可見大片纖維化區(qū)，梗死及周邊區(qū)可見大量炎性細胞浸潤，MSC組的梗死纖維化區(qū)及梗死邊緣區(qū)可見血管增生、炎細胞浸潤。電鏡下梗死模型組、MSCs組的梗死區(qū)可見大量纖維母細胞增生。與模型組比較，MSC組、MSC+丹參組，血清Ⅰ型膠原顯著增加，Ⅲ型膠原

6、也增加，但各組間無差異。與模型組比較， MSC組、丹參組、MSC+丹參組血清MMP-1均有所下降，TIMP-1增加，但各組間無差異。與正常組比較，模型組CVF顯著增加，Ⅰ/Ⅲ顯著下降；與模型組比較，MSC組、丹參組CVF下降，但MSC+丹參聯(lián)合組下降顯著；丹參組Ⅰ/Ⅲ增加，MSC+丹參聯(lián)合組Ⅰ/Ⅲ增加優(yōu)于單純MSC組。
　　 結論：
　　 1．采用結扎冠脈前降支的方法可成功建立兔心肌梗死模型。
　　 2．靜脈移植

7、骨髓間充質干細胞可以遷移至心肌梗死及周圍區(qū)。
　　 3．骨髓間充質干細胞移植可通過改善Ⅰ、Ⅲ型膠原比值使兔急性心肌梗死后膠原重構減輕。
　　 4．中藥丹參可以減輕心肌梗死后膠原重構，與干細胞移植聯(lián)合應用，效果更顯著。
　　 三、丹參聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對兔急性心肌梗死后心功能的影響及機制
　　 目的：觀察丹參聯(lián)合骨髓間充質干細胞移植對兔急性心肌梗死后心功能的影響，探討兩者是否具有協(xié)同治療作用，并從炎癥

8、、凋亡角度探討其作用機制。
　　 方法：取日本大耳白兔2只，穿脛骨骨髓，應用貼壁和密度梯度離心法分離、培養(yǎng)MSCs，傳至第3代，行5-溴脫氧核苷尿嘧啶（Brdu）標記。正常對照組10只，另60只建立急性心肌梗死模型，造模成功后隨機均分為4組，模型組、丹參組、MSC組、丹參+MSC聯(lián)合組。MSC組、丹參+MSCs組于造模成功后第7d靜脈注射MSC2×106；丹參組、丹參+MSC組于造模成功后靜脈注射丹參15.4mg/kg配制成溶液

9、，1次/d，共10d。各組分別于術后28d行多普勒超聲心動圖測量左室舒張期末內徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）。術后35d行病理學檢查，原位末端標記法（TUNEL）檢測梗死及周圍區(qū)心肌細胞凋亡指數；RT-PCR和Western blot法檢測NF-kb、bcl-2、fas、fasL的表達。
　　 結果：與模型組比較，丹參組、干細胞組和聯(lián)合組左室舒張末內徑均明顯縮小，左室短軸縮短率明顯增加，聯(lián)合組變化更顯著，但與干細胞組比

10、較無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，丹參組、干細胞組和聯(lián)合組凋亡細胞平均吸光度值明顯下降，聯(lián)合組比單純干細胞組下降更顯著。PCR與Western檢測均發(fā)現：模型組NF-kb、fas、fasL表達增加，bcl-2表達下降；干細胞組、聯(lián)合組NF-KB、fas、fasL表達下降，且聯(lián)合組下降更顯著；丹參組bcl-2水平增加，而干細胞及聯(lián)合組未見增加。
　　 結論：
　　 1．經靜脈移植MSC可改善兔急性心肌梗死后心功能。