凝乳酶高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件、產(chǎn)物酶學(xué)活性的相關(guān)研究.pdf

1、凝乳酶最初發(fā)現(xiàn)于未斷奶小牛的第四胃，是乳酪制造業(yè)中的關(guān)鍵性酶，同時(shí)在其他食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等領(lǐng)域都有應(yīng)用，其在酶工業(yè)中所占的產(chǎn)值比例高達(dá)15％。近年來由于全球性小牛短缺，人們逐漸將目光投向牛凝乳酶的代用品，其中，微生物凝乳酶以其優(yōu)秀的凝乳性狀和便捷的生產(chǎn)工藝受到了最廣泛的關(guān)注。英、美、荷、日等國率先開始了微生物凝乳劑的相關(guān)研究，我國在80年代初亦開始進(jìn)行相關(guān)研究，但目前還缺乏形成產(chǎn)業(yè)化的凝乳酶生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)乳酪所需的凝乳酶主要依賴于進(jìn)口

2、，因此進(jìn)行凝乳酶的相關(guān)研究具有較高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。本文主要進(jìn)行了微生物發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的相關(guān)研究，內(nèi)容包括：凝乳酶高產(chǎn)菌株的誘變選育，發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及產(chǎn)物分離方法和酶學(xué)活性的初步研究。
　　 誘變實(shí)驗(yàn)以購自ATCC的米黑毛霉、購自CICC的黑曲霉為出發(fā)菌株，分別對其依次進(jìn)行紫外線照射誘變、脫氧膽酸鈉誘變和常壓低溫等離子體誘變。以產(chǎn)物凝乳活性和非特異性蛋白水解活性為考量標(biāo)準(zhǔn)，通過平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最后選育

3、一株凝乳酶產(chǎn)量高，蛋白質(zhì)水解活力小的黑曲霉突變株L-2-12。以該菌株作為發(fā)酵生產(chǎn)菌株，產(chǎn)物中凝乳酶產(chǎn)量是原始黑曲霉菌株的4.28倍；是原始米黑毛霉菌株的3.39倍。遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，該誘變株基本保持產(chǎn)酶性狀穩(wěn)定。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以該菌株作為研究對象，試驗(yàn)菌株使用干燥沙土管法低溫保存。
　　 微生物發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，不同菌株處于不同營養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)條件下，菌體的代謝均會(huì)不同從而影響產(chǎn)酶，因此要提高酶產(chǎn)量，對發(fā)酵產(chǎn)酶的條件

4、進(jìn)行優(yōu)化是必不可少的一環(huán)。經(jīng)過對發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)組分和培養(yǎng)條件的單因素分析和發(fā)酵條件的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)研究，本文最終確立的培養(yǎng)條件為：每250mL錐形瓶分裝9g麩皮、1g面粉、0.1g脫脂乳粉，用15mL酸性無機(jī)離子營養(yǎng)液(按質(zhì)量體積比配制0.7％MgSO4·7H2O、0.9％FeSO4·7H2O、0.1％脯氨酸溶液，加0.2NHCl調(diào)節(jié)pH至6.61)浸潤，混勻并高溫滅菌，待涼后接種，37℃培養(yǎng)98h。經(jīng)過一系列優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)物

5、濃縮凍干后的凝乳酶活性最高可達(dá)21000SU。
　　 另外，實(shí)驗(yàn)對從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化凝乳酶粗酶的方法進(jìn)行了初步探索。凝乳酶在水溶液中不穩(wěn)定極易降解，因此初提取時(shí)，在充分發(fā)酵后即以水為溶劑，使用三步固液反相接觸萃取法從固體培養(yǎng)基中萃取出發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)過離心過濾后，迅速通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式濃縮粗酶液，凍干成粗酶粉。通過此方法得到粗酶粉設(shè)備簡單、便于操作且收率較高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 對凝乳酶粗產(chǎn)品進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的