釀酒酵母乙醇發(fā)酵工業(yè)菌株的RAPD分析與基因工程改造.pdf

1、甘蔗糖蜜作為我國(guó)南方蔗糖產(chǎn)區(qū)主要的乙醇發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)原料，具有低成本，不耗糧，并可解決制糖業(yè)污染等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其乙醇發(fā)酵的研究一直是研究的重點(diǎn)，其中很關(guān)鍵的問(wèn)題是獲得高性能的菌種，菌株的鑒定及選育具有重要意義。因此本論文工作主要從兩方面展開(kāi)，首先選擇單細(xì)胞形態(tài)及甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵表型不同的7株釀酒酵母工業(yè)菌株為研究對(duì)象，利用RAPD技術(shù)進(jìn)行核基因組多態(tài)性分析鑒定，以探討釀酒酵母核基因組多態(tài)性與相關(guān)性狀的關(guān)系;然后以全基因組分析為基礎(chǔ)進(jìn)一步對(duì)菌株

2、進(jìn)行改造，以選育高性能的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵釀酒酵母菌種。
　　 為滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)進(jìn)程要求，本實(shí)驗(yàn)建立了一種PCR模板高通量制備法，可以在3 min內(nèi)完成一株釀酒酵母的PCR模板制備工作。ITS擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果證實(shí)該法擴(kuò)增目標(biāo)條帶的專(zhuān)一性。釀酒酵母不同長(zhǎng)度核基因的擴(kuò)增及RAPD擴(kuò)增，證實(shí)該法相對(duì)于CTAB基因組法，具有時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。
　　 基于PCR模板高通量制備法進(jìn)行RAPD實(shí)驗(yàn)，先對(duì)22種隨機(jī)引物進(jìn)行篩選。利用8種引物

3、對(duì)7株釀酒酵母工業(yè)菌株進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明，系列菌株間的相似性系數(shù)在0.47-0.96之間，高產(chǎn)菌株1015-04-01與高產(chǎn)菌株1002-03-03之間的相似性最高，而高產(chǎn)菌株1015-04-01與低產(chǎn)菌株1415相似性最低。利用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，高產(chǎn)菌株1016-02-04，低產(chǎn)菌株1415及低產(chǎn)菌株1313聚為一大類(lèi)，而1415與1313又聚為一小類(lèi)，其它4株高產(chǎn)菌株聚為另一大類(lèi)。RAPD分析結(jié)果與系列菌株單細(xì)胞形態(tài)

4、及產(chǎn)酒性狀差異基本一致。
　　 分別以高產(chǎn)菌株1015-10-1，低產(chǎn)菌株1415作為基因改造對(duì)象與基因供體，進(jìn)行基因工程改造，在PCR模板高通量制備基礎(chǔ)上，篩選鑒定出突變子034-19。034-19菌株YFR034C基因的11、333等位點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照1015-10-01發(fā)生突變，位點(diǎn)11及333的突變分別導(dǎo)致203位點(diǎn)的異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸，310位點(diǎn)的纈氨酸變?yōu)楦拾彼?。相?duì)于對(duì)照，突變子生長(zhǎng)速度穩(wěn)定加快，產(chǎn)氣明顯加快，蔗糖發(fā)酵