釀酒酵母乙醇脫氫酶Ⅰ基因的超表達(dá).pdf

1、隨著世界范圍內(nèi)石油儲(chǔ)量的迅速減少，能源危機(jī)和環(huán)境污染已成為各國(guó)普遍存在的問題。發(fā)展可再生、安全、廉價(jià)的替代能源燃料乙醇不僅可以緩解能源危機(jī)，還可以顯著改善生態(tài)環(huán)境，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)被廣泛應(yīng)用于生物乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。近年來通過對(duì)釀酒酵母進(jìn)行基因改造以提高乙醇產(chǎn)量成為研究熱點(diǎn)。 釀酒酵母中有五個(gè)基因adh1-adh5編碼與乙醇代謝相關(guān)的乙醇脫氫酶(Adh1p-Ad

2、h5p)，其中除Adh2p催化將乙醇氧化為乙醛的反應(yīng)外，其他四種乙醇脫氫酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在葡萄糖發(fā)酵過程中還原乙醛生產(chǎn)乙醇，當(dāng)外界環(huán)境中的葡萄糖被耗盡后Adh2p負(fù)責(zé)催化利用乙醇作為碳源的初始反應(yīng)，而Adh1p在乙醛生成乙醇的過程中發(fā)揮著最為關(guān)鍵的作用。因此，阻斷Adh2p催化的乙醇分解代謝支路，同時(shí)增強(qiáng)Adh1p的作用極有可能提高釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力。 本課題組已成功地敲除了釀酒酵母adh

3、2基因，在此基礎(chǔ)上，利用重疊延伸PCR融合磷酸甘油激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)啟動(dòng)子和釀酒酵母乙醇脫氫酶基因Ⅰ(alcohol dehydrogenaseⅠ，adh1)，將該融合片段插入帶有G418抗性基因(KanMX)和loxP位點(diǎn)的pUG6質(zhì)粒中，并在adh1基因下游插入細(xì)胞色素c(Cytochrome c transcription，CYC1)終止子，構(gòu)建了釀酒酵母整合表達(dá)載體pUPGKAT。Tt

4、h111 Ⅰ內(nèi)切酶線性化后轉(zhuǎn)化釀酒酵母乙醇脫氫酶基因Ⅱ(adh2)敲除菌株YS2-△adh2。根據(jù)釀酒酵母同源重組機(jī)制，使adh1基因增加一個(gè)拷貝，且其中一個(gè)拷貝置于PGK強(qiáng)啟動(dòng)子下游。分別提取YS2-△adh2和YS2-△adh2-adh1總RNA并進(jìn)行SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明超表達(dá)突變菌株YS2-△adh2-adh1乙醇脫氫酶Ⅰ的mRNA是出發(fā)菌株YS2-△adh2的4.08倍。在PGK啟動(dòng)子調(diào)控下，乙醇脫氫