胸膜肺炎放線桿菌APXⅡA基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine pleuropneumoniae)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae,APP)引起的以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變的接觸性傳染病.該病在世界各地廣泛流行,常常造成巨大的經(jīng)濟損失.胸膜肺炎放線桿菌的14個血清型產(chǎn)生4種不同的APX毒素,即APX Ⅰ、APXⅡ、APXⅢ及APXⅣ.其中APXⅡ存在于除血清型10以外的所有血清型中,其操縱子僅包含激活基

2、因APXⅡC和結(jié)構(gòu)蛋白基因APXⅡA,但沒有分泌蛋白B和D基因.該毒素是胸膜肺炎放線桿菌的主要抗原之一,在該病的診斷和疫苗研制中占有重要地位.該試驗旨在利用APXⅡ為APP的主要抗原這一特點,在原核系統(tǒng)中對其結(jié)構(gòu)蛋白基因APXⅡ A進行表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物進行初步純化,為建立豬傳染性胸膜肺炎的ELISA診斷方法和基因工程疫苗的研制提供技術(shù)支撐.從國內(nèi)流行的主要血清型7型APP中提取菌體DNA,PCR方法擴增出APXⅡA基因,擴增產(chǎn)物連接到p

3、MD-18-T載體中,轉(zhuǎn)化JM109菌后進行篩選,得到的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR鑒定并經(jīng)測序證明所測結(jié)構(gòu)蛋白APXⅡ A核苷酸序列與國外GeneBank中的參考序列同源性為99.8﹪.隨后以重組質(zhì)粒為模板用特異性表達(dá)引物擴增得到目的基因APXⅡ A,對目的基因和表達(dá)載體pGEX-4T-1分別以相同的限制性內(nèi)切酶酶切后,經(jīng)連接酶連接構(gòu)建成重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)PLYSs后得到重組質(zhì)粒pGEX-APXⅡA,通過酶切及PCR

4、擴增鑒定篩選出陽性克隆,測序證明目的基因正確插入到表達(dá)載體.隨后用IPTG誘導(dǎo)APXⅡA基因的表達(dá),收集不同時間的菌液進行SDS-PAGE電泳、Western-blotting分析檢測.結(jié)果表明結(jié)構(gòu)蛋白APXⅡA基因在大腸埃希氏菌中能高效表達(dá),表達(dá)量占菌體蛋白總量的24.5﹪,表達(dá)的目的蛋白分子量約為102.5Kda,該表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白,能被傳染性胸膜肺炎陽性血清所識別.進一步的試驗證明表達(dá)產(chǎn)物為不溶性的包涵體蛋白,此包涵體蛋白不易降