大腸桿菌xylA和xylB基因的克隆與表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著人們對全球性能源危機認識的不斷加深及環(huán)境保護意識的不斷加強，開發(fā)新的替代能源已是刻不容緩的重大戰(zhàn)略問題。生物乙醇作為一種可再生的替代能源，日益受到各國的重視。如何利用廉價生物質等可再生資源進行生物乙醇生產已成為各國的研究熱點之一。 本中心在這樣的背景下進行Zymomonasmobilis基因工程改造，使其能發(fā)酵木糖生產乙醇。本文研究內容為中心大課題的一部分，即克隆并表達大腸桿菌木糖異構酶基因(xylA)與木酮糖激酶基因(xy

2、lB)。 首先通過紫外誘變、Ap富集與X-EMB平板篩選得到木糖營養(yǎng)缺陷型菌株787。通過PCR反應克隆大腸桿菌K12xylAB，PCR產物以pBSKS(+)為載體引入菌株787，經(jīng)篩選平板篩選和轉化子酶活測定判斷克隆得到的DNA片段即為目的片段xylAB。測序結果進一步證明克隆得到的DNA片段為目的片段xylAB。然后將xylAB與穿梭質粒pZB1相連構建成pZB1-xylAB質粒，并轉化DH5α與Z.mobilisCP4。最

3、后，利用PCR重疊延伸技術將大腸桿菌xylAB自身的啟動子換成Z.mobilisCP4的gap基因的啟動子，構建成pZB1-Pgap-xyIAB，并分別轉化DH5α與Z.mobilisCP4。 通過半胱氨酸-咔唑的方法測定菌株粗酶液的XI酶活，D-木酮糖-NADH耦聯(lián)法測定XK酶活，結果表明：大腸桿菌DH5α(pZB1-xylAB)XI酶活為DH5α(pZB1)的2倍，而XK酶活為DH5α(pZB1)的100倍，DH5α(pZB

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