高產(chǎn)纖維素酶菌株選育、分子鑒定及發(fā)酵工藝研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、纖維素酶在一切以植物為原料的加工業(yè)中,如釀造、果汁與蔬菜汁加工、糧食加工、食品、飼料、造紙、中草藥有效成分提取、植物基因工程和細(xì)胞工程以及原油開采、紡織工業(yè)、廢水處理、生物能源生產(chǎn)等各個方面,均有很大的應(yīng)用價值。目前關(guān)于纖維素酶方面的研究很多,主要瓶頸性的問題在于目前用于纖維素酶的生產(chǎn)菌如里氏木酶,青霉等,酶活力都比較低,纖維素酶用量大,成本高。高產(chǎn)纖維素酶的菌株,較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件以及適宜的酶反應(yīng)體系條件,都能提高纖維素酶活,有效的降

2、低纖維素酶的成本。
   本文從岳麓山枯枝腐木土壤下采樣,利用剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)良產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選,通過不同物理方法對其進(jìn)行誘變選育,并通過顯微鏡和16s rDNA對突變株進(jìn)行綜合的分子鑒定,并對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化條件進(jìn)行了考察,同時對纖維素酶的反應(yīng)體系條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究,主要結(jié)果如下:
   1.從自然界枯枝腐木土壤層下取樣,篩選出較高產(chǎn)纖維素酶的菌株A24,其CMCase酶活為20.37U/mL與FP

3、Aase酶活為1.20U/mL。
   2.對出發(fā)菌株A24,進(jìn)行紫外誘變,最佳時間為7min。在此條件下篩選獲得了一株遺傳穩(wěn)定性好而且CMCase酶活為25.35U/mL,F(xiàn)PAase酶活為1.33U/mL的突變株UV-37。對UV-37進(jìn)行60Co-γ射線誘變,最適誘變劑量為0.6KGy。在此條件下獲得一株遺傳穩(wěn)定性好而且纖維素酶活分別比野生菌提高了137.16%與118.80%的突變株Co-07。
   3.通過對

4、菌株的菌落、菌絲、以及孢子絲的形態(tài)進(jìn)行顯微鏡觀察,可以看出輻射狀的菌落,有較細(xì)的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及螺旋狀的孢子絲,從鏡檢形態(tài)上基本可以確定為鏈霉菌屬。對菌株的16s rDNA進(jìn)行擴(kuò)增、測序,利用。NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對,經(jīng)MEGA5.0軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹后可以確定為鏈霉菌屬中的三澤鏈霉菌亞種。
   4.通過產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),最終得到的最優(yōu)外部產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為:50mL裝液量,175r/min轉(zhuǎn)速,

5、40℃,發(fā)酵120h,CMC酶活可達(dá)到74.06U/mL。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳碳源為稻草粉,濃度為2.5%,氮源對本菌株產(chǎn)酶的影響不大,而磷酸鹽的最佳濃度為4%。由裝液量、稻草粉、磷酸鹽(KH2PO4)為主要影響因素的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最終的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為表明3個因素對產(chǎn)酶都有極顯著的影響。通過SAS9.1軟件所建立的優(yōu)化模型,其R2=99.80%,能較好的模擬實(shí)際實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面優(yōu)化后的最終條件為:裝液量(X1)=60mL,稻草粉(X2

6、)=2.8%,KH2PO4(X3)=4.2%,CMC酶活為94.16U/mL。
   5.通過對本菌中CMC酶反應(yīng)體系的研究,初步得出最佳的酶促反應(yīng)體系:經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液,在pH6.0的環(huán)境下,底物濃度為1.0%的體系中,于50℃水浴中,酶促反應(yīng)30min后,加入3.0mLDNS,煮沸10min。通過對纖維素酶相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的研究,CMC酶活在40℃與50℃的條件下,熱穩(wěn)定很好,70℃時,熱穩(wěn)定較差。CMC酶活在pH值6.0時,

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