大菱鲆過(guò)敏原小清蛋白的制備及氧化對(duì)其IgE結(jié)合能力的影響.pdf

1、隨著魚類作為食品原料越來(lái)越廣泛的應(yīng)用到食品工業(yè)中，魚類過(guò)敏的發(fā)病率逐年提高，這一方面要求對(duì)食品中的魚類過(guò)敏原進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)，另一方面需要提高魚類過(guò)敏的診斷效果。世界很多國(guó)家都對(duì)食品中魚類過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，主要采用酶聯(lián)免疫的方法，由于魚類地域性差異及國(guó)際貿(mào)易日漸擴(kuò)大等問(wèn)題，針對(duì)我國(guó)的對(duì)魚類過(guò)敏原特性的研究無(wú)論是對(duì)食品工業(yè)中魚類過(guò)敏原的檢測(cè)，還是對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域魚類過(guò)敏的診斷都具有重要的意義。
　　本研究針對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖和消費(fèi)量比較大的大菱鲆(S

2、cophthalmus maximus)，根據(jù)過(guò)敏原的已知特性對(duì)天然過(guò)敏原進(jìn)行提取和純化，由于抽提所得蛋白在冷凍儲(chǔ)藏期間其含量和活性均出現(xiàn)不同程度的降低，從而探討了過(guò)敏原在儲(chǔ)藏過(guò)程中的蛋白質(zhì)氧化對(duì)過(guò)敏原活性的影響。鑒于天然過(guò)敏原存在不穩(wěn)定、量小難以控制等問(wèn)題，考慮利用基因工程技術(shù)對(duì)大菱鲆過(guò)敏原進(jìn)行分子克隆，制備重組的小清蛋白，來(lái)獲取穩(wěn)定的、安全的、重現(xiàn)性好的魚類過(guò)敏原。主要結(jié)果如下：
　　1.建立規(guī)范的大菱鲆過(guò)敏原抽提方法

3、　　大菱鲆過(guò)敏原小清蛋白是典型的酸性小分子蛋白質(zhì)，三個(gè)亞基之間會(huì)形成的聚集體，采用12種提取液對(duì)大菱鲆蛋白進(jìn)行抽提，通過(guò)對(duì)其IgE結(jié)合能力進(jìn)行檢測(cè)能夠獲得較好的蛋白質(zhì)抽提方法。加入DTT后，Tris，Glycine提取液抽提的蛋白質(zhì)的含量增加13.46％，IgG結(jié)合能力提高6.22%，并利用免疫印跡等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Tris、Glycine和DTT提取液抽提的16ku，36ku，41ku和46ku的蛋白能夠與3位過(guò)敏患者的血清發(fā)生強(qiáng)烈

4、的免疫反應(yīng)。和未加入DTT的同一種提取液相比，加入DTT的提取液獲得的蛋白的含量和活性較高。加入DTT的Tris，Glycine提取液獲得的蛋白濃度最高為4.51mg/mL；與過(guò)敏患者的血清結(jié)合能力比其他提取方法高。因此加入DTT的Tris，Glycine提取液可以用于大菱鲆過(guò)敏原的抽提。建立標(biāo)準(zhǔn)化的過(guò)敏原提取程序?qū)εR床診斷和治療是非常必要的，本研究旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的魚類過(guò)敏原的提取系統(tǒng)。
　　2.探討氧化作用對(duì)大菱鲆過(guò)敏原蛋白的影

5、響
　　為了探明蛋白質(zhì)儲(chǔ)藏過(guò)程中蛋白含量及活性的變化規(guī)律，本文以大菱鲆為研究對(duì)象，采用羥基自由基氧化體系對(duì)大菱鲆過(guò)敏原進(jìn)行不同程度的氧化，檢測(cè)其功能基團(tuán)的變化規(guī)律，并分別利用魚類過(guò)敏患者血清和兔抗大菱鲆小清蛋白多克隆抗體分析大菱鲆過(guò)敏原小清蛋白免疫功能的變化規(guī)律。結(jié)果表明：大菱鲆蛋白經(jīng)過(guò)5h氧化，27%的蛋白質(zhì)發(fā)生了沉淀。另外，氧化5h后上清液中和沉淀中的蛋白的羰基含量分別增加了9.7倍和2.0倍，上清液中和沉淀中蛋白的巰基含量分

6、別降低了13.5%和29.1%。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中的12ku、26ku和41ku處蛋白的含量減少，然而沉淀中36ku左右的蛋白含量隨著氧化時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，可能是小分子蛋白聚集的結(jié)果。免疫印跡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組蛋白與魚類過(guò)敏的患者血清之間的特異性反應(yīng)強(qiáng)度降低。ELISA結(jié)果表明經(jīng)過(guò)5h氧化處理后上清液中和沉淀中大菱鲆過(guò)敏原的活性分別降低了16.7%和31.5%。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明氧化改變了大菱鲆蛋白的理化性質(zhì)，并可能改變了大菱鲆蛋白的結(jié)構(gòu)

7、，進(jìn)而影響了大菱鲆過(guò)敏原蛋白的功能性質(zhì)。
　　3.重組蛋白的表達(dá)，鑒定及純化
　　利用分子克隆技術(shù)對(duì)大菱鲆小清蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)而將其結(jié)構(gòu)和免疫活性與天然蛋白進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)通過(guò)SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)前后菌體蛋白組成，結(jié)果表明表達(dá)后的電泳圖譜比表達(dá)前多出一條帶（分子量約15ku），大腸桿菌成功表達(dá)出重組蛋白。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)此蛋白可以與兔抗大菱鲆小清蛋白抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；E