基于合成生物學(xué)的地雷檢測(cè)方法研究.pdf

1、地雷是一種常見(jiàn)的隱蔽性極高的防御性爆炸火器。早在公元1130年就有地雷使用的相關(guān)記錄。19世紀(jì)中葉以后，烈性炸藥2，4，6-三硝基甲苯的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了地雷制式化、多樣化的發(fā)展，地雷作為一種廉價(jià)、高效的防御武器一直沿用至今。
　　地雷的應(yīng)用對(duì)現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用，地雷以其高隱蔽性和高殺傷性的優(yōu)勢(shì)，使其幾乎受到了歷次現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)的青睞，因此如何在戰(zhàn)場(chǎng)上安全、有效地偵測(cè)出地雷埋藏位置，是所有交戰(zhàn)雙方必須解決的問(wèn)題。此外，地雷對(duì)有生力量

2、的殺傷作用并不僅僅在戰(zhàn)爭(zhēng)過(guò)程中，地雷的長(zhǎng)效性和殺傷性并不隨戰(zhàn)爭(zhēng)的結(jié)束而終結(jié)，許多地雷在戰(zhàn)場(chǎng)上并未引爆或排除，這些遺留地雷至今仍在威脅著當(dāng)?shù)厝嗣竦纳踩Ｒ虼酸槍?duì)地雷安全、有效的偵測(cè)方法一直是各國(guó)軍事武器專(zhuān)家廣為研究的課題。
　　傳統(tǒng)的地雷檢測(cè)方法有生物探測(cè)、金屬探測(cè)、聲波探測(cè)、雷達(dá)探測(cè)等，這些傳統(tǒng)的探測(cè)手段有一定的局限性。生物探測(cè)主要基于動(dòng)物對(duì)于氣味的感官反應(yīng)，由于動(dòng)物思想不可控制，探測(cè)具有很大的不確定性;金屬、聲波和雷達(dá)探測(cè)主

3、要基于探測(cè)者的主觀(guān)判斷，并且大多數(shù)情況下需要身赴雷區(qū)，具有很大的危險(xiǎn)性，并且無(wú)法針對(duì)目前出現(xiàn)的陶瓷、塑料等新型材質(zhì)的地雷進(jìn)行探測(cè)。為了解決以上這些問(wèn)題，基于合成生物學(xué)的地雷檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生。該方法可依據(jù)地雷的爆炸填充物為靶標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)，規(guī)避了地雷材質(zhì)的問(wèn)題。利用細(xì)菌進(jìn)行群體檢測(cè)可以有效地避免個(gè)體主觀(guān)差異對(duì)探雷的影響，提高地雷檢測(cè)的客觀(guān)準(zhǔn)確性，可以與傳統(tǒng)的地雷檢測(cè)方法互為補(bǔ)充，進(jìn)而提高地雷檢測(cè)的準(zhǔn)確性和安全性。
　　合成生物學(xué)是

4、20世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)基于生命科學(xué)的多學(xué)科交叉新興學(xué)科。目前合成生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要可以分為以下三個(gè)層次:一是對(duì)自然界已知功能的生物元件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)，進(jìn)而形成模塊，根據(jù)工程學(xué)思想，自下而上進(jìn)行逐級(jí)組裝，構(gòu)建出具有全新功能的基因線(xiàn)路或生命系統(tǒng);二是隨著基因合成技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)人工設(shè)計(jì)、合成、組裝新的生命體基因組，實(shí)現(xiàn)生命體的重構(gòu);第三個(gè)層次建立在前兩個(gè)層次的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造完整的全新生物系統(tǒng)，乃至人工生命體。
　　生物傳感器的構(gòu)建系基

5、于合成生物學(xué)研究?jī)?nèi)容的第一層次，通過(guò)挖掘自然界中對(duì)靶標(biāo)化合物敏感的感應(yīng)元件與適于體現(xiàn)感應(yīng)強(qiáng)度的報(bào)告元件進(jìn)行組裝，通過(guò)對(duì)報(bào)告元件所產(chǎn)生信號(hào)的讀取分析，感應(yīng)出靶標(biāo)化合物的濃度、位置等信息。
　　本研究擬構(gòu)建的地雷探測(cè)生物傳感器也主要由感應(yīng)元件和報(bào)告元件構(gòu)成，目前生物傳感器報(bào)告元件的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，主要有l(wèi)uxCDABE、GFP、lacZ等。研究主要以地雷的常規(guī)爆炸裝填物2，4，6-Trinitrotoluene(TNT)為靶標(biāo)分子，

6、挖掘自然界存在的感應(yīng)元件，并對(duì)其進(jìn)行一系列分析和改造以提高感應(yīng)活性，或通過(guò)自然界中已有報(bào)道的一些可感應(yīng)TNT的調(diào)控線(xiàn)路，構(gòu)建基因傳感線(xiàn)路，最后圍繞合成生物學(xué)生物傳感器的構(gòu)建，搭建可用于細(xì)菌自裂解的基因模塊，以期實(shí)現(xiàn)完整生物傳感器的構(gòu)建。
　　研究?jī)?nèi)容主要分為以下幾個(gè)方面:
　　(1)天然TNT感應(yīng)元件發(fā)掘
　　選擇實(shí)驗(yàn)室遺傳操作最為明晰的大腸桿菌入手，進(jìn)行大腸桿菌的TNT天然感應(yīng)元件挖掘。為了便于啟動(dòng)子文庫(kù)的構(gòu)建與篩選

7、，首先構(gòu)建了一個(gè)可用于啟動(dòng)子篩選的載體pTJH629，向載體中引入了大腸桿菌低拷貝復(fù)制子pSC101 ori。
　　通過(guò)提取純化E.coli K-12 MG1655基因組，并利用SA U3AI內(nèi)切酶對(duì)其完全酶切，以luxCDABE化學(xué)發(fā)光為報(bào)告手段構(gòu)建大腸桿菌基因組天然啟動(dòng)子文庫(kù)，經(jīng)過(guò)高低濃度TNT的兩輪篩選，在文庫(kù)中得到具有一定特異性和靈敏度的5個(gè)啟動(dòng)元件，并對(duì)5個(gè)啟動(dòng)元件進(jìn)行特異性、靈敏度、時(shí)效性分析，發(fā)現(xiàn)其具有較好的啟動(dòng)活性

8、。
　　通過(guò)對(duì)5個(gè)元件基因序列的進(jìn)一步分析，在大腸桿菌基因組中比對(duì)得到相應(yīng)位置序列信息，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及啟動(dòng)子在線(xiàn)預(yù)測(cè)等方法，得到了各個(gè)元件序列中可能存在的啟動(dòng)序列。接著利用體外直接退火擴(kuò)增的方法，得到這些序列，并針對(duì)啟動(dòng)元件對(duì)TNT的敏感性進(jìn)行研究，以對(duì)元件的最小功能序列進(jìn)行確證，最后確證了其中兩個(gè)元件發(fā)揮功能的最小序列topAp4和recEA4。
　　(2)基于應(yīng)激損傷機(jī)制的人工啟動(dòng)子文庫(kù)構(gòu)建與篩選
　　通過(guò)上一

9、步中對(duì)大腸桿菌基因組中啟動(dòng)元件的篩選發(fā)現(xiàn)，topA和recEA4均屬于細(xì)菌SOS家族成員，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌應(yīng)急損傷家族可以受到TNT的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此進(jìn)一步對(duì)SOS家族的基因啟動(dòng)子進(jìn)行了考察，從中得到了幾個(gè)對(duì)TNT有明顯誘導(dǎo)反應(yīng)的啟動(dòng)子。通過(guò)對(duì)篩選得到的SOS啟動(dòng)元件進(jìn)行序列分析，從其中序列共性較多的啟動(dòng)子(sulA、recA、umuDC)著手，對(duì)其序列的保守區(qū)進(jìn)行提取，對(duì)其可變區(qū)進(jìn)行完全隨機(jī)突變，構(gòu)建SOS啟動(dòng)子的隨機(jī)突變文庫(kù)

10、。在文庫(kù)中對(duì)TNT感應(yīng)情況進(jìn)行考察，從中篩選出了5個(gè)可受TNT調(diào)控的全新的SOS啟動(dòng)子，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)特性的考察，發(fā)現(xiàn)其在保證特異性、時(shí)效性等特性的基礎(chǔ)上其靈敏度較野生型SOS啟動(dòng)子都有顯著提升。
　　(3)惡臭假單胞菌XylR5-Pu-GFP測(cè)線(xiàn)路構(gòu)建
　　惡臭假單胞菌mt-2能夠以甲苯硝基衍生化合物中的硝基作為氮源進(jìn)行生理代謝，因此惡臭假單胞菌中肯定存在可受TNT誘導(dǎo)的調(diào)控元件，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能的關(guān)鍵元件為T(mén)OL質(zhì)

11、粒上的XylR-Pu線(xiàn)路。XylR蛋白作為惡臭假單胞菌甲苯代謝通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可受甲苯及其衍生化合物的調(diào)控反應(yīng)，激活上游的Pu啟動(dòng)子，根據(jù)此調(diào)控原理，以文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)2,4-Dinitrotoluene（2，4-DNT）特異的XylR突變體XylR5為調(diào)控因子，以GFP為報(bào)告基因，構(gòu)建了XylR-Pu-GFP基因調(diào)控線(xiàn)路。利用重組工程方法將線(xiàn)路整合到假單胞菌基因組上，并通過(guò)Cre-loxP實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建過(guò)程中抗性基因的敲除，實(shí)現(xiàn)了生物傳

12、感器基因工程菌的菌株構(gòu)建。同時(shí)搭建了一個(gè)質(zhì)粒平臺(tái)pSN129，可通過(guò)對(duì)平臺(tái)上的元件進(jìn)行替換，實(shí)現(xiàn)線(xiàn)路功能的轉(zhuǎn)換。
　　(4)可受阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)菌自裂解模塊構(gòu)建
　　為了實(shí)現(xiàn)基因工程菌對(duì)環(huán)境的無(wú)污染、無(wú)殘留，本研究還開(kāi)展了對(duì)生物傳感器的檢測(cè)后自毀模式的研究。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)了T4噬菌體的穿孔素蛋白Holin與T4溶菌酶的配合使用可調(diào)控實(shí)現(xiàn)細(xì)菌自殺，以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)構(gòu)建了pBAD-Holin-Lysozyme-AntiHolin

13、的自殺線(xiàn)路，通過(guò)引入Holin拮抗蛋白AntiHolin的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了含有自殺表達(dá)模塊的菌株的正常生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)替換AntiHolin的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)其不同強(qiáng)度的表達(dá)，也可使自殺的起效時(shí)間、自殺強(qiáng)度高低得到一定控制。
　　綜上所述，在本研究中以大腸桿菌基因組為模板，構(gòu)建了基因組天然啟動(dòng)子文庫(kù)，從中篩選得到了5個(gè)可受TNT誘導(dǎo)的天然啟動(dòng)子元件，其啟動(dòng)活性均達(dá)到或超過(guò)了國(guó)際上報(bào)道的元件的領(lǐng)先水平;結(jié)合篩選結(jié)果與文獻(xiàn)調(diào)研，通過(guò)對(duì)大腸桿菌S

14、OS應(yīng)激損傷系統(tǒng)的啟動(dòng)子篩查，得到了幾個(gè)可受TNT調(diào)控的SOS啟動(dòng)子，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)了一個(gè)SOS啟動(dòng)子的隨機(jī)突變文庫(kù)，并在文庫(kù)中篩選得到了5個(gè)全新的SOS啟動(dòng)元件，并且其靈敏度較同類(lèi)元件有顯著提高;通過(guò)對(duì)假單胞菌天然元件XylR-Pu的應(yīng)用，構(gòu)建了XylR5-Pu-GFP基因工程菌，并實(shí)現(xiàn)了基因組引入抗性的剔除，并且構(gòu)建了一個(gè)基因線(xiàn)路平臺(tái)pSN129，可便捷的替換元件改變功能;通過(guò)對(duì)T4噬菌體Holin蛋白與穿孔素蛋白作用原