保健食品中他達(dá)那非類(lèi)藥物免疫檢測(cè)方法研究.pdf

1、他達(dá)那非作為第二代磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制劑，是一種治療男性勃起功能障礙的處方藥，經(jīng)常被非法添加到聲稱(chēng)具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、補(bǔ)腎壯陽(yáng)等功能的保健食品中。但此類(lèi)藥物與硝酸酯類(lèi)藥物同時(shí)服用會(huì)引起低血壓，甚至死亡。因此，加強(qiáng)對(duì)此類(lèi)藥物非法添加的監(jiān)控對(duì)保障食品安全至關(guān)重要。目前，此類(lèi)藥物的檢測(cè)主要依賴(lài)于液相色譜、氣相色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用等大型儀器手段。但是，大型儀器分析方法檢測(cè)成本高、需要專(zhuān)業(yè)的操作人員、且不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，難以普及，尤

2、其是在經(jīng)濟(jì)支持薄弱的基層單位。免疫分析法是運(yùn)用抗原抗體反應(yīng)與酶促反應(yīng)相結(jié)合的一種快速、靈敏、低成本、易于現(xiàn)場(chǎng)操作的檢測(cè)技術(shù)，可與大型儀器確證技術(shù)形成互補(bǔ)，高低搭配，滿(mǎn)足大批量樣品的快速、篩查確證檢測(cè)需求。目前，有關(guān)PDE-5抑制劑他達(dá)那非類(lèi)藥物的免疫檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以他達(dá)那非為對(duì)象，開(kāi)展半抗原/抗原設(shè)計(jì)合成、動(dòng)物免疫及寬譜特異性抗體制備、間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法和膠體金免疫層析試紙條等研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：

3、　　（1）以氨基他達(dá)那非為原料設(shè)計(jì)合成出了5種半抗原 H1~H5，并通過(guò)偶聯(lián)載體蛋白進(jìn)行動(dòng)物免疫及抗血清的篩選，制備得到了2種高效的能夠特異性識(shí)別他達(dá)那非類(lèi)藥物的抗體PAb-H5-AmTD-MA和PAb-H5-AmTD-MA-KLH，在1μg/mL他達(dá)那非藥物條件下，其抑制率分別為89％和95%。
　　（2）基于PAb-H5-AmTD-MA抗體建立了檢測(cè)他達(dá)那非類(lèi)藥物的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析（ic-ELISA）方法。通過(guò)優(yōu)化確定了最

4、佳反應(yīng)參數(shù)：包被原濃度為32.15 ng/mL，抗體稀釋倍數(shù)為8 k，藥物稀釋緩沖液為pH8.4的0.01 mol/L含0.2%吐溫-20的PBST，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間為40 min，二抗反應(yīng)時(shí)間為30 min，顯色時(shí)間為10 min，體系中甲醇濃度控制在5%以?xún)?nèi)，建立了ic-ELISA方法，該方法對(duì)他達(dá)那非的檢測(cè)限（LOD）為0.027 ng/mL、IC50為0.90 ng/mL、線(xiàn)性范圍（IC20-IC80）為0.099~8.22 ng/

5、mL；保健酒、膠囊等固體和液體保健食品樣品中他達(dá)那非的平均添加回收率在84.92%~116.19%之間，變異系數(shù)在6.37%~14.28%之間，與 HPLC-MS/MS方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好（R2=0.9993）。
　?。?）基于 PAb-H5-AmTD-MA-KLH抗體制備了檢測(cè)他達(dá)那非類(lèi)藥物的膠體金免疫層析試紙條（GICA）。通過(guò)檸檬酸還原法燒制了~16nm的膠體金溶液，并優(yōu)化確定了最佳方法條件為：膠體金標(biāo)記抗體時(shí)膠體金溶液

6、pH值為8.5、抗體用量為0.75μg/mL；金標(biāo)抗體及包被原濃度均不稀釋最佳，此時(shí)金標(biāo)抗體濃度為原始膠體金溶液的1/10，包被原濃度為1 mg/mL；最佳的樣品墊膜材質(zhì)為GF-06；樣品墊處理液為0.2 M pH7.5 Tris-HCl緩沖液；藥物稀釋液為0.01 M pH7.4的PBST，其甲醇含量最好不超過(guò)5%；質(zhì)控線(xiàn)二抗稀釋倍數(shù)為30倍，此時(shí)二抗?jié)舛葹?.27 mg/mL，進(jìn)一步構(gòu)建了定量分析GICA試紙條，對(duì)他達(dá)那非的檢測(cè)范圍

7、為0.71~141.99 ng/mL，IC50為10.04 ng/mL；保健酒、膠囊等固體和液體保健食品樣品中他達(dá)那非的平均回收率在93.34%~121.50%，平均變異系數(shù)在0.95%~13.33%，與HPLC-MS/MS方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性良好（R2=0.9598）。
　　（4）采用以上兩種方法對(duì)保健酒類(lèi)液體樣品及固體樣品盲樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)9種保健酒中有3種檢測(cè)為陽(yáng)性，13種固體樣品中有4種檢測(cè)出為陽(yáng)性，且含量均在μg/mL以上